202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre

5

HU 202 587 B

6

dalomból, és például az alábbi közleményekben megadottak szerint vitelezhetők ki: Itakura és munkatársai, Science, 198,1056 (1977) és Crea és munkatársai, Proc.

Nat. Acad. Sei., 75,5765 (1978), USA. Ilyen szekvencia például az alábbi, szemléltető és nem limitáló jelleggel bemutatott dezoxi-ribonukleotidok:

1.

5 ’ -CTAG AGGGTA TTAA TA

1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1

ATG 1 1 1

If i II 1 1 1 1 II 1

3’ TCCCATAATTAT

1 1 I

TAC

c

ATG 1 1 1

TTC CCA GCC ATG TCC

III III Ml III III

TTG 1 1 1

J

1 1 1 TAC

III III III III III

AAG GGT CGG TAC AGG

1 1 1 AAC

GTGCT 3’

l

C

5’

10

2.

5’-CTAGAGGGTA T TAATA

I | I f 1| I I I I II

ATG 1 1 1

1 1 M II 1 1 1 1 1 1

3’ TCCCATAATTAT

1 1 1 TAC

15

CCT 1 1 1

GCT ATG TCC TTG TCC

III Ili Ili III III

GGC 1 1 1

1 1 1 GGA

III III III III III

CGA TAC AGG AAC AGG

1 1 1

CCG

20

3.

5’ CTAG AGGGTA TTAA TA

M 1 I M 1 1 1 II 1

ATG

1 1 Í

1 I 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1

3’ TCCCATAATTAT

1 1 1 TAC

ATG

I 1 i

TCC TTG TCC GGC CTG

III II 1 Ili M 1 III

nr 1 1 1

25

1 i 1

TAC

III I II III III III

AGG AAC AGG CCG GAC

1 1 1 AAA

4.

5’ CTAG AGGG TAT TAA TA

1 1 1 1 II II M 1 1

ATG 1 1 1

30

I 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1

3’ TCCCATAATTAT

1 1 1

TAC

GCC

1 I 1

ATG TCC TTG TCC GGC

III II 1 III III III

CTG 1 1 1

1 1 1 CGG

III III III III III

TAC AGG AAC AGG CCG

1 1 i

GAC

35

5.

5’ CTAGAGGGTA A A TTCT

I I I I M I II M I

ATG 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 II II 1

3’ TCCCA TT TAAGA

1 1 1

TAC

GCT

ATG TCC TTG TCC GGC

CTG

40

1 1 1

CGA

III III III III III

TAC AGG AAC AGG CCG

1 1 1

GAC

A fenti nuklcotid-szekvenciákat egymástól függetlenül hozzákapcsolhatjuk a pCZIOl plazmid dezoxi-ribonukleinsav 10,2 kb nagyságú BamHl-Xbal és a 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fr^gmenscihez, amikor sorrendben megkapjuk az alábbi jelű plazmidokat: pCZIOl.1, pCZIOOO, pCZIOOO.l, pCZ1060 és pCZ1120. Ezek a plazmidok transzkripciót követően egyetlen policisztronos mRNS molekulát szintetizálnak, ez leírja mind az előpeptidet, mind pedig a met-bGH-t.

A találmányt nem limitáljuk egy adott transzkripciós aktivációs szekvencia használatára, mivel egy specifikus szekvencia kiválasztása nem kritikus a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága szempontjából. Az előzőekben példaként említett lipoprotein aktivációs szekvencia helyett használhatunk például, nem limitáló

TTC

i i i

CCA 1 1 1

TTG 1 1 1

GAT 1 1 1

GAT 1 1 1

GAT 1 1 1

TAA

1 1 I

i i i

AAG

1 I 1

GGT

1 1 1 AAC

I 1 1

CTA

1 1 1 CTA

1 I 1

CTA

1 1 1 ATT

TCC

i i i

GGC 1 1 1

CTG 1 1 1

TTT

1 I 1

GCC

1 1 I

AAC

} 1 1

GCT 1 1 1

i i i

AGG

1 1 1 CCG

1 1 1 GAC

1 1 1 AAA

1 1 1 CGG

1 1 1 TTG

1 1 1 CGA

GAT 1 1 1- O- > -o

GAG 1 1 1- O

= 25

TAA 1 1 1

ATG 1 1 1

TTT

i i i

1 1 1

CTA

1 1 1 GTC

1 1 1 CTC

t i i

CTA

1 1 1 ATT

1 1 1 TAC

i I I

AAA

CTG 1 1 1

TTT 1 1 1

GCC

1 I 1

AAC 1 1 1

GCT 1 1 1

GTGCT

1

3’

1 1 1

GAC

1 1 1

AAA

1 I 1

CGG

1 1 1 TTG

1 1 I

CGA

1

C

5’

GAT 1 1 1

CAG

1 I 1

TAA 1 1 1

ATG 1 1 1

TTT

I 1 I

CCG 1 1 1

GCT 1 1 1

1 1 1 CTA

1 1 1 GTC

1 1 1

ATT

1 1 1 TAC

I 1 1

AAA

1 1 1

GGC

1 1 1 CGA

GCC 1 1 1

AAC 1 1 1

GCT

I 1 1

GTGCT

1

3’

1 1 1

CGG

1 1 1 TTG

I 1 1

CGA

1

C

5’

GAT 1 1 1

GAT

1 1 I

AAG

1 f 1

TAA 1 1 1

ATG

1 1 I

TTC 1 1 1

CCA

1 1 I

1 1 1

CTA

1 1 1

CTA

1 1 1 TTC

1 1 1

ATT

1 1 1

TAC

1 1 1 AAG

1 1 1 GGT

TTT 1 1 1

GCC

I 1 1

AAC 1 1 1

GCT 1 1 1

GTGCT

1

3’

1 1 1

AAA

I 1 1

CGG

TTG

1 1 1

CGA

C

5’

GAT 1 1 1

GAT

1 i 1

AAG 1 1 1

TAA 1 1 1

ATG 1 1 1

TTT

i i i

CCG 1 1 1

1 1 1 CTA

I 1 1

CTA

1 1 1

TTC

1 1 1 ATT

1 1 1 TAC

i i i

AAA

1 1 1 GGC

TTT

1 1 1

GCC

1 I 1

AAC 1 1 1

GCT 1 1 1

GTGCT

1

3’

I I 1

AAA

1 I 1

CGG

1 1 1 TTG

1 1 1

CGA

C

5’

50 jelleggel, más, az alábbiakban felsorolt transzkripciós aktivációs szekvenciákat is: E. coli triptofán (trp), E. coli laktóz (lac), lambda bakteriofág PlOl. lambda bakteriofág PrOr, Bacillus subtilis vegetatív (veg) vagy Streplomyces azureus tiosztrepton rezisztencia (tsr) gén 55 transzkripciós aktivációs szekvenciát. Ezen kívül kettesével is felhasználhatunk egy vagy több transzkripciós aktivációs szekvenciát, például a trp és a lac transzkripciós aktivációs szekvenciákat A fenti szekvenciákat korábban jellemezték; szintetikusan előállíthatók vagy is- 60 mert plazmidokból izolálhatok.

Részletesebben szólva, a triptofán (trp) transzkripciós aktivációs szekvenciát megkapjuk, ha a pHI7A4Al plazmidot EcoRI-Clal emésztésnek vetjük alá. A pHI7A4Al plazmid az 5. példában megadottak szerint 65 állítható elő. Mivel a pHI7A4Al plazmidban több Taql

4