202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
3 HU 202 587 B 4 transzlációs stop jelet a pepiid vagy polipeptid karboxil-terminális részét leíró nukleotid triplet szomszédságában és attól 3’-irányban, tartalmaz továbbá egy, a fenti stop jeltől 3’-irányban és közvetlenül szomszédosán egy transzlációs start szignált, továbbá c) egy funkcionális polipeptidct meghatározó nukleotid-szekvenciát, amely funkcionális polipeplidet leíró szekvencia tartalmaz a funkcionális polipeptid karboxil-terminális nukleotid tripletjének szomszédságában és attól 3’-irányban egy transzlációs stop szignált, azzal a feltétellel, hogy a vektor szelektálható és autonóm replikálódik. A találmány szerinti vektorok előállítására az alábbi Xbal-HgiAI dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvenciát beépítjük a pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal és 0,6 kb nagyságú BamHI-HGiAI fragmenseibe: 5 ’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTC CTA CTA ATT TAC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT AAG GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA GTGCT-3’ C------5’, ahol A dezoxi-adenil-csoport, G dezoxi-guanil-csoport, C dezoxi-citozil-csoport és T timidilcsoport. A kapott plazmidot pCZ114 jellel jelöljük, és tartalmaz 1. az E. coli lipoprotein génjének transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját [Nakamura és Inouye, 1979, lásd előbb] leolvasási fázisban egy olyan nukleotid-szekvenciával, amely leír mind egy riboszóma kötőhelyet, mind pedig egy alábbi aminosav sorrendi pepiidet: MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP, ahol MET metionin, PHE fenil-alanin, PRO prolin, LEU leucin, GLU glutaminsav és ASP aszparaginsav; 2. tartalmaz továbbá a fenti pepiidet meghatározó szekvenciához képest megfelelően elhelyezett és leolvasási fázisban levő transzlációs stop jelet; 3. a fenti stop szignál szomszédságában fekvő 3’irányban egy transzlációs start jelet, és amely leolvasási fázisban helyezkedik el a metionil borjú növekedési hormont (met-bGH) leíró nukleotidszekvenciával; továbbá 4. a met-bGH-t kódoló szekvenciával leolvasási fázisban levő és megfelelően elhelyezett transzlációs stop jelet. Akiindulási pCZIOl plazmid 10,8 kb nagyságú, előállítására a pNM789B plazmid 0,6 kb nagyságú Xbal-BamHI fragmensét ligáljuk a hasonló restrikciós végekkel rendelkező pIM-I’-A3 plazmiddal. Az utóbbi plazmid tartalmazza az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, tartalmaz egy termoindukálható úgynevezett runaway (elveszthető) replikont. A plazmid az E. coli K12 RV308/pIM-I’-A3 törzsből állítható elő. A törzset letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törzsgyűjteményében, ahol az az NRRL B-15733 sorszámot kapta. A pNM789B kiindulási plazmid a pKENI 11 plazmidból származik, ahogy az az 1-8. ábrákból és az alábbi 1. példából kiderül. A pKENI 11 dezoxi-ribonukleinsavat az E. coli K12 CC6720/pKENlll törzsből állítjuk elő, a törzset NRRL B-15011 sorszámon helyeztük letétbe a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois állandó törzsgyűjteményében. A pNM789B dezoxi-ribonukleinsav szintén tartalmazza az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját, és ezen kívül tartalmazza a megfelelően elhelyezett transzlációs stop jellel együtt azt a kódoló szekvenciát, amely leír egy fúziós proteint. Ez utóbbi fúziós protein a szarvasmarha növekedési hormon fehérjéből cs ennek amino-terminális végén elhelyezkedő kilenc aminosavból álló polipeptidből áll. A fenti, az Xbal-BamHI fragmensen elhelyezkedő transzkripciós aktivációs és fúziós proteint leíró szekvencia ligálásakor a megfelelően hasított pIM-I’-A3 dezoxi-ribonukleinsavhoz eredményezi a pCZIOl kiindulási plazmidot. A témában jártas szakember felismeri, hogy a fent leírt Xbal-HgiAI dezoxi-ribonukleinsav linker molekula fontos része a pCZ114 szemléltető jelleggel bemutatott plazmidnak. A linker szekvencia kódolja 1. azt a transzlációs aktivációs szekvenciát, amely egy pepiidet és egy riboszóma kötőhelyet leíró nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban van, 2. megfelelően elhelyezett és az előző pepiidet kódoló szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs stop szignált és 3. egy olyan transzlációs start jelet, amely a fentiekben ismertetett stop jel közvetlen közelében helyezkedik el 3’-irányban, és amely leolvasási fázisban van a met-bGH-t kódoló szekvencia egy részével. A met-bGH-t kódoló szekvencia további része (ideértve a megfelelően elhelyezett transzlációs stop jelet) és egy transzkripciós aktivációs szekvencia könnyen kialakítható a pCZIOl plazmid megfelelő fragmensén ligálással. Ligálás után például a 10,8 kb nagyságú, szemléltető jelleggel bemutatott metionil-szarvasmarha növekedési hormont (met-bGH) kifejező pCZ114 plazmidhoz jutunk. A témában jártas szakember felismeri, hogy az első peptid és a met-bGH funkcionális polipeptid nem fúzionált géntermék, hanem inkább egyetlen policisztronos mRNS transzkriptumból leíródó transzlatált és szeparált protein. A pCZU4 dezoxi-ribonukleinsav restrikciós térképét a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be. A találmány szerinti eljárást bemutató több rokon bGH-t kifejező plazmidot állíthatunk elő. Bár egy adott dezoxi-ribonukleinsav linker-szekvencia meg kell hogy maradjon, legalább két szeparált polipeptid kifejezésére egyetlen mRNS molekuláról, a felhasználható linker dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák száma gyakorlatilag végtelen. Ezeket a szekvenciákat ismert módon szintetizálhatjuk a módosított foszfo-triészter módszerrel, teljesen védett didezoxi-ribonukleotid építőköveket használva. A szintetikus módszerek jól ismertek az iro5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
