202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
1 HU 202 587 B 2 A találmány új, szelektálható és autonóm replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektorokra vonatkozik. A találmány szerinti vektorok tartalmaznak: 1. egy olyan transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, amely egy pepiidet vagy polipcptidct meghatározó nuklcotid-szekvenciával leolvasási fázisban van; 2. egy transzlációs stop jelet; 3. egy funkcionális polipeptidet meghatározó nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban levő transzlációs start jelet; továbbá 4. egy további transzlációs stop jelet A fenti nukleotid-szekvenciát transzkripció után transzlatálható policisztronos mRNS generáására készítettük. A találmány tárgya továbbá a fentiek felhasználása. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia fejlődését és kiterjedését nagymértékben limitálja erős génkifejeződést biztosító vektorok hiánya. Bár az alábbi promoter rendszereket már beépítették rekombináns dezoxi-ribonukleinsav vektorokba, ezeken kívül más kifejeződő rendszer lényegében nem áll rendelkezésünkre: lac [Roberts és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76, 55% (1979); és Guarante és munkatársai, Cell., 20, 543 (1980)], trp [Hallewell és Emtage, Gene, 9, 27 (1980) ], a lambda bakteriofág PL [Remaut és munkatársai, Gene, 15,81 (1981); Bemard és munkatársai, Gene, 5. 59 (1979) és Derom és munkatársai, 77, Gene, 45 (1982)] és Ipp [Ziebel és munkatársai, J. Bacteriol., 145, 654 (1981); Lee és munkatársai, J. Bacteriol., 146, 861 (1981) és Nakamura és Inouye, Cell, 18, 1109 (1979)]. Tény, hogy sok heterológ (idegen) gén nem fejeződik ki, vagy legjobb esetben a fenti ismert kifejeződő vektorokat használva a kifejeződés mértéke gyenge. A kifejeződés hiánya gyakran összefügg a mRNS transzkripciójával, mivel ez szuboptimális vagy nem képes kötődni a riboszómákhoz. Ennek oka lehet a nem megfelelő hurokszerkezet kialakulása, amely létrehozza a riboszóma kötőhelyet, oka lehet a mRNS általános instabilitása vagy olyan szekvenciák jelenléte, amelyek gátolják a riboszómához való kötődést vagy a transzlációs elindulást. Egyik esetben sem mutatható ki a transzláció, és ennek következtében a szükséges polipeptid nem fejeződik ki vagy nem termelődik. A találmány szerinti eljárással ezeket a nehézségeket megoldjuk anélkül, hogy egy gént szintetikusan kelljen módosítanunk. A gén szintetikus módosítása nemcsak időigényes munka és drága, de jelentősen növeli annak a veszélyét, hogy hibák kerülnek a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciába. A találmány szerinti eljárással ezt a problémát megoldjuk úgy, hogy az mRNS transzkriptum 5’-végét megváltoztatjuk anélkül, hogy módosulna vagy megváltozna a számunkra érdekes gén szekvenciája. A leírásban bizonyos kifejezéseket használunk, amelyek magyarázatát az alábbiakban adjuk meg: Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor: olyan autonóm replikálódó molekula, például - de nem limitálóan - plazmid, amely dezoxi-ribonukleinsav molekulához egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens kapcsolható, vagy amelyhez ilyen szegmenst kapcsoltunk. Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő (expressziós) vektor: olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor, amelybe egy vagy több transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát építettünk be. Transzkripciós aktivációs szekvencia: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szckvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a dezoxi-ribonukleinsav átírását hírvivő ribonukleinsav (mRNS) transzkriptuminá. Transzlációs aktivációs szekvencia: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a hírvivőribonukleinsav transzkriptum ábrását egy pepiiddé vagy polipcptiddé. Transzlációs start jel: olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely a transzlációs start kodont határozza meg. Transzlációs stopjel: olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely egy transzlációs stop kodont ír le. Transz fönn áció: dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása rccipicns gazdasejtbe, amely ezáltal új genotípust képvisel. Transzformáns: transzformált recipiens gazdasejt. Restrikciós fragmens: egy vagy több restrikciós enzim hatása révén generált lineáris dczoxi-ribonuklcinsav-szckvencia. Funkcionális polipeptid: kinyerhető, biológiailag aktív heterológ (idegen) polipeptid vagy prekurzor, egy kinyerhető, bioaktív, heterológ polipeptidből és homológ polipeptid egy részéből vagy teljes egészéből álló polipeptid, vagy olyan kinyerhető, biológiailag inaktív fúziós polipeptid termék, amely egy heterológ polipeptidből és egy biológiai aktivitást megszüntető polipeptid részből áll, ez utóbbi specifikusan hasítható. Fuzionált géntermék: olyan kinyerhető, heterológ polipeptid, amely egy homológ polipeptid egy részét vagy teljes egészét tartalmazza. Az alábbiakban megadjuk a találmányhoz mellékelt ábrák leírását: 1-4. ábra: a pNM575 plazmid előállításának sematikus ábrázolása. 5-8. ábra: a pNM789B plazmid előállításának sematikus ábrázolása. 9. ábra: a pCZ114 és pCZ105.1 plazmidok restrikciós térképe. 10. ábra: a pCZ1140 plazmid restrikciós térképe. 11. ábra: a szintetikus timozin alfa 1 gén. 12. ábra: a T15 nukleotid-fragmens szintézisének protokollja. 13. ábra: a pTHal plazmid előállítása. 14. ábra: a szintetikus proinzulin gén. 15. ábra: a pHI7 A4A1 plazmid előállítása. 16. ábra: a pHI104 plazmid előállítása. A találmány tárgya eljárás rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektor előállítására. Úgy járunk el, hogy összekapcsolunk a) egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, b) egy riboszóma kötőhelyet és egy peptidet vagy polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav linkért, amely peptidet vagy polipcptidct kódoló szekvencia tartalmaz egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
