202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
13 HU 202 586 B 14 málunk és tenyésztünk. A transzformált sejteket egy éjszakán át minimál táptalajon növesztjük, 550 nm-en 1,2 O.D. értékig. Ezután további táptalajt adunk hozzá. 10 pg/ml koncentráció eléréséig indol-akrilsavat adagolunk, amelynek szerepe a triptofán operonnal kontrollált gének expressziójának további indukciója. A sejteket két órán át inkubáljuk, majd összegyűjtjük. Míg az itt leírt proteáz-rezisztens urokináz variánsok előállítása során a pUK54trp207-l*TX plazmidot használtuk, meg kívánjuk jegyezni, hogy szakember számára nyilvánvaló módon más expressziós vektorok is alkalmasak erre a célra. Amire szükség van, az kizárólag urokinázt kódoló klónozott DNS. Ezt a DNS-t vagy szintézissel készítjük, vagy alkalmas sejtekből, például Detroit 562 sejtekből (ATCC CCL 138) mRN S-t izolálunk, amelyből cDNS-t készítünk (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Erre a DNS-re az jellemző, hogy DNS és aminosav szekvenciájában legalábbis lényegében homológ az 1. ábrán bemutatott natív urokináz szekvenciával. A DNS szekvenciában alkalmas restrikciós enzim helyeket határozunk meg és használunk szükség esetén adaptorok és linkerck alkamazásával együtt, hogy olyan DNS-hez jussunk, amely beépíthető a választott expressziós vektorba. Más plazmid szerkezete és gazdavektor rendszerek alkalmazása a szakember köteles tudásához tartozik. 3. példa A (Lys135-»A; Phe157Lys158—>A) humán urokináz tisztítása 200 g sejtmasszát, melyet egy 10 literes fermentor féléből a 2. példa szerint gyűjtünk össze, 4 °C-on 10 liter 0,05 mólos Tris-ben (pH 7,2) homogenizálunk, amely 0,5 g/liter lizozimet (Sigma) és 0,01-0,01 g/litcr ribonukleázt (Sigma) és dezoxiribonukleázt (Sigma) tartalmaz. Az oldatot háromszor átengedjük egy Menton Gaulin malmon, 30.106 Pa nyomáson, és 30 percen át 4700 g-vel 5 ’C-on centrifugájuk. A kapott pelletct, amely SDS-PAGE és „Western blotting” módszerrel meghatározva urokinázt tartalmaz, homogenizálással 500 ml 0,05 mólos Tris-ben és 0,02 mól/1 EDTA-ban (pH 7,2) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 1,3 liter 50%os glicerinre rétegezzük, majd ismét 30 percen át 4700 g-vel centrifugáljuk. Az urokinázt, amely az üledékben van, 6-8 órás keveréssel, 4 'C-on feloldjuk 300 ml 6,0 mólos guanidin-hidrokloridban. Az oldhatatlan anyagokat 30 perces, 4700 g-vel végzett centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót 6,0 literre hígítjuk. A 9,0-es pH-jú pufferben a sók végső koncentrációja a következő: 0,05 mól/1 Tris, 1,0 mól/1 guanidin-hidroklorid, 0,2 mól/1 arginin, 0,005 mól/1 EDTA, 0,005% Tween 80, 1,25 mmól/1 redukált glutation és 0,25 mmól/1 oxidált glutation. A 6,0 literes térfogatszámítások szerint OD^o < 1 értéket ad. Az oldatot 24 órán át 4 'C-on állni hagyjuk, hogy fibrin lemez vizsgálattal maximális aktivitáshozamokat kapjunk. A visszazáró reagenseket 4 'C-on kétszer 60 liter, 0,05 mólos 0,005% Tween 80-at tartalmazó oldattal szemben dializálva távolítjuk el. A dialízis egy éjszaka alatt teljessé válik. Minden ezt követő tisztítási lépést 4 'C-on végzünk. A dializált oldatot szakaszosan, a dialízis pufferrel egyensúlyba hozott DE-52 cellulóz (Whatman) 400 mles adagjaival extraháljuk. Az iszapot Buchner tölcséren átszűrjük. A nem adszorbeált urokinázt tartalmazó felülúszót azonnal felvisszük egy 100 ml-es (5x5 cm) hidroxi-apatit (BioRad) oszlopra, amelyet előzőleg a dialízis pufferrel egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 0,005% Tween 80-at tartalmazó, 0,125 mólos pH 6,8) nátrium-foszfát pufferrel mossuk. Az urokinázt 0,4 mólos (pH 6,7) 0,005% Tween 80-at tartalmazó nátrium-foszfáttal eluáljuk. A hidroxi-apatit oszlopról kapott eluátumot YM10 Amicon szűrő alkalmazásával körülbelül 30 ml-re koncentráljuk, és felvisszük egy 0,05 mólos (pH 6,8), 1,0 mól guanidin-hidrokloridot és 0,005% Tween 80 puffert tartalmazó nátrium-foszfát pufferrel egyensúlyba hozott, 2,5 x 130 cm-es Sephacryl S-200 oszlopra. Az urokinázt tartalmazó frakciót összegyűjtjük és 100 térfogategység 0,005 mólos (pH 7,3), 0,15 mól/1 nátrium-kloridot és 0,005% Tween 80-at tartalmazó nátrium-foszfáttal szemben dializáljuk. 4. példa A (Lys136->A; Phe^Lys^-^A) humán urokináz aktivitása Az urokinázt és mutánsait fibrin lemezeken (Ploug J. et al. Urokinase: An activator of plasminogen from human urine. I. Isolation and Porperties. „Biochim. Biophys. Acta” 24: 278-282 1957) vizsgáltuk. A fibrin lemezek 1,25% agarózból, 4,1 mg/ml humán fibrinogénből, 0,3 egység/ml trombinból és 0,5 pg/ml szójabab tripszin inhibitorból álltak. Az urokinázt és mutánsait közvetlenül, kromogén szubsztráton (S-2444, Helena Laboratories, Beaumont, Texas) (Hayashi S. et al. Assay of urokinase activity in plasma with a chromogenic substrate. „Thrombosis Research” 22: 573-578 1981) is vizsgáltuk. Minden vizsgálat során, az abszolút aktivitások megállapításához urokináz standardot (Calbiochem) használtunk. A (Lys136->A; Phc^Lys^g-^A) humán rekombináns urokináz, a rekombináns natív HŰK (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés) és natív HŰK relatív aktivitását fibrin lemezes vizsgálatokkal hasonlítottuk össze. Az eredmények a megadott sorrendben a következők voltak: 96 250, 126 200 és 121 200 Poug egység (PE/mg). Ez azt mutatja, hogy a három aminosav deléciója nem módosította lényegesen a mutáns urokináz plazminogén aktiváló kapacitását. A mutáns 300 PE-jc az S-2444 alapján csak 0,76 PE kromogén aktivitást tartalmazott Ez csak körülbelül 0,25%-a volt a natív urokináz S-2444 aktivitásának. Azt a következtetést vontuk le, hogy vagy a mutáns bizonyos maradék S- 2444 aktivitást mutatott vagy fellépett bizonyos korlátozott átalakulás a kétláncú formává. Elvégeztük a (Lys136—>APhe157Lys258-»A) humán urokináz és a rekombináns egyes szálú natív urokináz plazminon történő összehasonlítását is. Amikor 0,0625 egység plazmint adtunk 300 PE (fibrin lemez) mutánshoz és az egészet egy órán át 37 *C-on inkubáltuk, egy 10,36 PE S-2444 aktivitású enzim termelődött, míg sokkal kisebb mennyiségű (0,005 egység) plazmin és rövidebb (15 perc) 37 'C-on végzett inkubálás 50 PE rekombináns egyes szálú natív urokinázzal egy sokkal nagyobb (—45 PE) S-2444 aktivitású enzimet eredményezett. A kettős szálú és plazminnal inkubált rekombináns natív és rekombináns mutáns urokinázok S-2444 specifikus aktivitását a következő táblázatban foglaljuk össze: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
