202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
15 HU 202 586 B 16 Enzim S-2444 aktivitás (P x 103/mg) rekombináns egyes szálú HŰK 89.0 2 szálú rekombináns HŰK 102.2 2 szálú natív HŰK 92.7 mutáns rekombináns egyes szálú HŰK 3.3 Látható, hogy a mutánst sokkal kevésbé aktiválja a plazmin, mint a natív molekulát Megjegyzés: A fenti példákban leírt eljárási műveleteket - amennyiben a példában más megadva nincs - az önmagukban ismert műveletek szokásos körülményei között folytattuk le. A részletekre vonatkozólag utalunk a szakmában használatos laboratóriumi kézikönyvekre pl.: Maniatis etc.: Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor 1982, valamint Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel etc. Eds. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987. Egyes, a példákban részletesen nem ismertetett standard oldatok és reagensek összetétel: LB közeg: tripton (Difco 0123) 10,0 g élesztókivonat (Difco 0127) 5,0 g nátriumklorid 10,0 g 1 liter desztillált vízben YT közeg: Bacto-Tryptone (Difco 0123) 8,0 g élesztókivonat (Difco 0127) 5,0 g nátriumklorid 5,0 g 1 liter desztillált vízben 20 x SSC: 3 mólos nátrium-klorid-oldat (175 g/1) 0,3 mól/1 Na3-citráL 2H2 (88 g/1) 1 mólos hidrogén-klorid-oldaltal 7,0 pH-ra beállítva (2 x SSC oldatot a fenti törzsoldat 10-szeres hígításával állítunk eló) NP40: a SIGMA Chemical Company, SL Louis, Mo. USA által előállított „Nonidet P. 40” készítmény rövidített elnevezése. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) képlet szerinti am inosav-szek véne iában a 156-158 és kívánt esetben a 135-136 helyeken megváltozott aminosav-szekvenciájú proteáz-rezisztens egyes szálú urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. az (I) képletben a 156-158 és kívánt esetben a 135— 136 aminosav helyeket kódoló DNS szakaszokat a megváltozó aminosav szekvenciájának megfelelően megváltoztatjuk, 2. valamely baktériumsejt- vagy állati szövettenyészetet, előnyösen E. coli sejtet az 1. lépés szerint megváltoztatott DNS szakaszt tartalmazó vektorral transzformálunk, 3. a transzformált gazdasejtet mindaddig tenyésztjük, amíg az urokináz-variáns felgyülemlik a tenyészetben és 4. az urokináz-variánst a tenyészetből kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás: Lys1Ä—»A; Phe157Lys15g—»A urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosavváltozásoknak megfelelően megváltoztatod DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás Lys136—»A urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosav-változásokoak megfelelően megváltoztatott DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás Lys13S-»A Phe1S7Lysi58-»A urokináz előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi kör szerinti aminosavváltozásoknak megfelelően megváltoztatott DNS szakasszal rendelkező vektorral transzformáljuk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS szakaszokat helyspecifikus mutagenezissel változtatjuk meg. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az urokinázt úgy nyerjük ki a tenyészetből, hogy a) az egyes szálú urokinázt tartalmazó refraktív testeket összegyűjtjük, b) az urokinázt - a refraktív testekben szolublizáljuk, c) a nem kívánatos proteineket kation-cserélő gyantán adszorbeáljuk, d) a szolubilizált urokinázt hidroxi-apatiton adszorbeáljuk, és e) az urokinázt eluáljuk a hidroxi-apatitról. 7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított proteáz-rezisztens urokinázt gyógyszerészetileg elfogadható vivő- és segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 9
