202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
15 HU 202 585 B 16 gel rendelkezik, a kódoló szál timidin-nukleotíddal kezdődik. A timidinnel kezdődő SÍ enzimmel emésztett Hindin vég Klenow polimeráz I enzimmel kezelt BglII helyhez kapcsolható oly módon, hogy a BglII restrikciós hely ligáció után helyreáll. Úgy járunk el, hogy a 2C) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2 plazmidot BglII restrikciós cndonukleázzal hasítjuk, és a kapou BglII ragadós végeket kétszálúvá egészítjük ki Klenow polimeráz I enzimmel, a 4 dezoxi-nukleotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott terméket EcoRI enzimmel hasítjuk, majd a kis fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elcktro-elucióval izoláljuk. Ily módon olyan rövid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amely tartalmazza a triptofán promoter/operátor rendszert, és a BglII helytől balra eső proximális LE’ szekvenciát meghatározó kodonokat. A termék EcoRI véggel és a BglII hely feltöltése lévén egy tompa véggel rendelkezik. A BglII helyet ugyanakkor újra visszaállítjuk oly módon, hogy a tompa véget hozzákötjük a fentiek szerint SÍ enzimmel emésztett HindlII fragmens tompa végéhez. A két fragmenst T4 dezoxi-ribonuklcinsav-ligázzal kapcsoljuk össze, amikor megkapjuk a rccirkularizált pHKYlO plazmidot, amit E. coli 294 kompetens sejtekbe transzformálva szaporítunk. A rckombináns pHKYlO plazmidot hordozó telraciklin-rczisztens sejteket szelektáljuk és izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonuklcinsavat. Ezt BglII és Psü enzimmel emésztjük, majd a nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és clektro-elucióval izoláljuk. Ily módon megkapjuk a Psü és BglII ragadós végekkel rendelkező, lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. A pHKYlOplazmidból előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmens tartalmazza a rcplikációs origót, és így felhasználható a pIA7A4Al plazmid előállításakor, amelyben mind a trp LE’ polipeptid fúziós protein, mind pedig a tetraciklin rezisztenciát kódoló gének a trp promoter/operátor rendszer szabályozása alatt állnak. G) Trp promoter/operátor rendszert tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása A 2E) példában megadottak szerint előállított pSOM7A2A4 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós endonukleázzal részlegesen, majd Psü enzimmel emésztjük. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátort; ezt poliakril-amid gél-elektroforézissel és clektro-elucióval izoláljuk. EcoRI enzimmel végzett részleges emésztést azért végzünk, hogy olyan fragmenshez jussunk amely a szomatosztaün gén 5’-végénck szomszédságában hasadt, de nem vágódott el az az EcoRI hely, amely az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén és a trp promoter/operátor rendszer között helyezkedik el. A Psü enzim által katalizált hasadás miatt elvesztcu ampicillin rezisztencia visszaállítható oly módon, hogy a 2F) példában megadottak szerint előállított lineáris végső pHKYlO dezoxi-ribonukleinsavval ligálunk. H) Az inzulin A láncát meghatározó strukturgén izolálása Az inzulin A lánc strukturgénjét a pIAl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével állítjuk elő. A plazmid előállítását Goeddel és munkatársai írják le [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76, 106 (1979)]. Az adott fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és az ezt követő elektro-elucióval üsztítjuk, a fragmens EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. I) Az inzulin A lánc strukturgénjének, a Trp promoter/operátor rendszer és a Psü és BglII végekkel rendelkező pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása Az inzulin A lánc strukturgénjét, a 2G) példában megadottak szerint előállított, trp promoter/operátort tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst és a 2F) példában megadottak szerint kapott pHKY 10 lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst az 1. ábrán megadott orientációban összekapcsoljuk, amiután megkapjuk a pIA7A4Al plazmidot. A pIA7A4Al plazmid könnyen szelektálható, mivel az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének ismét jelen vannak. 3. példa A plB7A4 A1 plazmid előállítása A 2A) - I) példákban megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az inzulin A lánc génje helyett a végső ligáláskor az inzulin B láncot meghatározó strukturgént használjuk. Az inzulin B lánc strukturgénjét a pIB 1 plazmid EcoRI és BamHI emésztésével kapjuk. Ezt a plazmidot Goeddel és munkatársai írják le 1979-ben. Az inzulin B láncot kódoló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektro-elucióval üsztítjuk, a termék EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. A 3. ábrán bemutatott pIB7A4Al plazmid könnyen szelektálható, mivel ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének jelen vannak. 4. példa A pHI7A4Al plazmid előállítása A pHI7A4Al plazmid előállítását a mellékelt 11. ábrán adjuk meg. A) A pSOM7A4Al plazmid előállítása A 21) példában megadottakat ismételjük meg. Úgy járunk el, hogy a 2G) példában megadottak szerint előállított, trp promoter/operátor rendszert tartalmazó lineáris dezox i -ribonukleinsav-fragmenst és a 2F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmcnst ismert módon kapcsoljuk a pSOMll plazmid szomatosztaün gént tartalmazó Eco- RI-BamHI restrikciós fragmenséhez. A pSOMll plazmidot Itakura és munkatársai szerint állítjuk elő [Science, 198, 1056 (1977)] és [2 007 676A sorszámú brit szabadalmi közlemény]. A pSOM7A4Al plazmidot az ampicillin rezisztenciát meghatározó gén jelenléte miatt könnyen szelektálhatjuk. B) A proinzulin 32 N-terminális aminosavát kódoló szintetikus gén előállítása A proinzulin első 32 aminosavát kódoló gén előállításának első lépéseként 18, a II. táblázatban megadott oligonukleotidot állítjuk elő. Az egyes nukleotidokat A, T, C vagy G betűkkel jelöljük, ezek az adenint, timint, citozint vagy guanint jelentik. A 10. ábrán bemutatjuk az előállított gén teljes nukleoüd-szekvenciáját. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
