202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
17 HU 202 585 B 18 II. táblázat A szomatosztatin szintetikus úton előállított oligonukleotidjai Vcgyület Szekvencia Hl AATTCATGTT H2 CGTCAATCAGCA H3 CCTTTGTGGTTC H4 TCACCTCGTTGA H5 TTGACGAACATG H6 CAAAGGTGCTGA H7 AGGTGAGAACCA H8 AGCTTCAACG B1 AGCTTTGTAC B2 CTTGTTTGCGGT B3 GAACGTGGTTTC B4 TTCTACACTCCT B5’ AAGACTCGCC B6 AACAAGGTACAA B7 ACGTTCACCGCA B8 GTAGAAGAAACC B9 AGTCTTAGGAGT B10’ GATCCGGCG A 10. ábrán a szintetikus nuklcotidokat zárójelek között adjuk meg, és aláhúzzuk. A nukleotidokat az alábbi szerzők által kidolgozott triészter-módszcrrel állítjuk elő: Crea és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978)]; Itakura és munkatársai [J. Bioi. Chem., 250,4592 (1975)]; és Itakura és munkatársai [J. Am. Chem. Soc., 97,7327 (1975)]. Egyes oligonukleotidokat felhasználunk a Crea és munkatársai által leírt (1978), továbbá Goeddel és munkatársai (1979) által ismertetett humán inzulin B láncot meghatározó gén előállítására. Két oligonukleotid, a B5’ és BIO’ Hpall és terminális BamHI és EcoRI restrikciós helyeket tartalmaz. A terminális helyek különösen előnyösen használhatók klónozásra. A humán inzulin B lánc baloldali felének génjét előzőleg Goeddel és munkatársai (1979) az előzőekben megadott nyolc oligonukleotidból (H1-H8) állították elő, ezek a B lánc 1-13 aminosavát meghatározó kodonokat tartalmazzák, tartalmazzák továbbá az N-terminális melionin-egységet. A B lánc génjének jobboldali felét a Blt B2, B3, B4, B5., B6, B7, Bg, B, és B10. oligonukleotidokból állítjuk elő T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kivitelezett ligációval Goeddel és munkatársai szerint eljárva (1979). A kapott gén-fragmens a humán inzulin B láncának 14-30. aminosavait határozza meg, és az összekötő lánc első argininjét. A gén-szekvenciába egy Hpall restrikciós helyet építünk be, hasonló leolvasási fázisban és elhelyezkedésben, mint ahogy a Hpall hely a humán inzulin génben helyezkedik el. A ligáit génfragmens tisztítását poliakril-amid gél-elektroforézissel végezzük, a legnagyobb dezoxi-ribonukleinsav-fragmensnek megfelelő csíkot eluáljuk. A fragmenst HindlII - BamHI-hasított pBR322 plazmidba építjük be. A kapott pB3 jellel jelzett plazmidot E. coli K12 294 (ATCC 31446) sejtekbe juttatjuk transzformációval. A plazmid ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határoz meg, és tartalmazza az adott nuklcotid-szekvenciát, amit Maxam és munkatársai szerint határoztunk meg [Proc, Natl. Adac, Sei., USA, 74560, (1977)]. Az 58 bázispárból álló pB3 Hindin - BamHI fragmenst és a pBHl plazmid 46 bázispárból álló EcoRI - Hindin fragmensét összekapcsoljuk, amikor EcoRI és BamHI végekkel rendelkező fragmenst kapunk. A pBHl plazmidot Goeddel és munkatársai (1979) írták le. A kapott fragmenst a pBR322, EcoRI és BamHI enzimekkel emésztett plazmid-fragmensekhez kapcsoljuk Goeddel és munkatársai szerint (1979) eljárva. A kapott plazmidot pIB3 jellel jelöljük, amit E. coli K12 294 sejtekbe transzformálunk. Az ismert módon kivitelezett sokszorosítást és izolálást követően a pIB3 plazmidot EcoRI és Hpall restrikciós enzimekkel kezeljük, amikor megkapjuk all. ábra első fragmensét, azaz olyan szintetikus gén-fragmenst, amely a proinzulin N-terminális aminosavait határozza meg, amelyeket egy metionin előz meg. A szintetikus gént poliakril-amid gél-elektroforézissel ismert módon izoláljuk. C) A humán proinzulin 50 C-terminális aminosavait meghatározó cDNS izolálása A mellékelt 12. ábrán adjuk meg az adott cDNS előállításának módszerét. Úgy járunk el, hogy egy BamHI enzim állal felismerhető szekvenciát és egy, körülbelül 20 csoportból álló 3’-politimidinsav részt tartalmazó, alábbi összetételű dekanukleotidot szintetizálunk: pCCGGATCCGG i l llgT. A szintetikus dekanukleotidot a cDNS szintézishez használt vírus reverz transzkriptáz primerjeként használjuk fel. A prímért terminális dczoxi-nukleotidil-transzferázzal (Enzo Biochem, 200 egység) állítjuk elő, 0,6 ml, 1,5 x 10"* pM TTP-t és 1 pM BamHI dekanukleotidot tartalmazó reakcióelegyben. A reakciót 1 órán át végezzük 37 'C hőmérsékéleten, Chang és munkatársai által leírt [Nature, 275, 617 (1978)] puffer-rendszerben. A humán inzulinoma szöveteket az alábbi helyről szereztük be: Institute für Diabetesforschung, München, Német Szövetségi Köztársaság. A témában jártas szakember megérti, hogy a humán inzulin szövet könnyen hozzáférhető és több forrásból megszerezhető. A humán inzulinoma szövet poli-A mRNS-ét (2,5 pg) Ullrich és munkatársai szerint [Science, 196,1313 (1977)] izoláljuk, és Wickens és munkatársai szerint [J. Bioi. Chem., 253, 2483 (1978)] kétszálú cDNS-sé alakítjuk át. Részletesebben szólva, úgy járunk el, hogy 80 pl, 15 mmól trisz-hidrogén-kloridot, (pH = 8,3, 42 °C hőmérsékleten), 21 mM kálium-kloridot, 8 mM magnéziumkloridot, 30 mM ß-merkapto-etanolt, 2 mM dCCGGATCCGGTT18T-t, továbbá 1 mM dNTPs-t tartalmazó reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten előinkubálunk. Vírus reverz transzkriptáz adagolását követően 15 percen át 42 °C hőmérsékleten inkubálunk. A kapott RNS/DNS-t ismert módon denaturáljuk. A komplementer cDNS szálat 150 pl alábbi összetételű reakcióelegyben szintetizáljuk: 25 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,3, 35 mM kálium-klorid, 4 mM magnézium-klorid, 15 mM ß-merkapto-etanol és 1 mM dNTPs, továbbá 9 egység dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I (Klenow-fragmcns). A reakciót 15 'C hőmérsékleten végezzük 90 percen át, majd 15 órán át 4 ’C hőmérsékleten. Ezután 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten S1 -nukleázos kezelést végzünk, a reakcióelegy hez 1000 egység Sl-nuklcázt adagolunk [Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA], A reakciót Wickens és munkatársai szerint végezzük (1978). 0,37 pg kétszálú cDNS-t 8% poliakril-amid gélen elektroforézissel tisztítunk, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
