202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
13 HU 202 585 B 14 továbbá az inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)], és a növekedési hormon [Goeddel és munkatársai, Nature, 281,544 (1979)] génjét is. 10 grg-nyi mennyiségű T2-T15 oligonuklcotidot kvantitatívan foszforilezünk (gamma- P32)-adenozin-trifoszfáttal [New England Nuclear] T4 polinukleotid-kináz jelenlétében [Goeddel és munkatársai (1979)], amikor 1 Ci/mmól specifikus aktivitású terméket kapunk. A radioaktívan jelzett fragmenseket 20% poliakril-amidot/7 mól karbamidot tartalmazó gélen clcktroforézisscl fragmentáljuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós eleklroforézis/részlcgcsen emésztett kígyóméreg homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids, Res., 1, 331 (1974)]. ATj és T16 fragmenseket nem foszforilezzük, ezzel minimálisra csökkentjük a következő ligációs reakció során bekövetkező, előnytelen polimcrizációl. 2-2 pg oligonuklcotidot négy fragmcnsből álló négy csoportba gyűjtjük össze (lásd a mellékelt 9. ábrát), az összekapcsolást T4 dczoxi-ribonuklcinsav-ligázzal végezzük, ismert módon [Goeddel és munkatársai, 1979], A reakciótermékeket 7 mól karbamidot tartalmazó, 15%-os poliakril-amid gélen végzett eleklroforézisscl tisztítjuk [Maxam és Gilbert, Proc.Nat. Acad. Sei., USA, 77,345 5 (1977)]. A 4 izolált terméket ligáljuk, és a rcakcióclegyet 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen végzett eleklroforézisscl frakcionáljuk. A ihimozinal génnek megfelelő, 90-105 bázispárból álló dezoxi-ribonuklcinsavat elektrocluáljuk. 0,5 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRI restrikciós endonuklcázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakril-amid gélen végzett clcktroforézissel elkülönítjük. A nagyobb fragmenst clcktroelucióval izoláljuk a gélről, és ezután a kapcsolt, szintetikus dezoxi-ribonuklcinsavhoz ligáljuk [Goeddel és munkatársai (1979)]. Ezzel az eleggycl E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. A transzformációs elegy 5%át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarra szélesztjük. A kapott 4 ampicillin rezisztens telep tetraciklinre érzékeny; ez azt jelentheti, hogy a beépülés a tctraciklin rezisztenciát meghatározó génbe történt. A 4 telepből izolált plazmidok analízise azt jelzi, hogy a pThal jellel jelzett mindegyik plazmid tartalmaz; a) a pBR322 plazmidban magában található BglII helyet, ami azt jelenti, hogy a thimozinal gén jelen van, ahogy azt a 7. ábrán bemutatjuk; tartalmaz továbbá b) 105 bázispárból álló BamHI/EcoRI hasítással kapott fragmenst A pThal plazmid előállításának lépéseit a mellékelt 9. ábrán adjuk meg, ahol a vastag jelzés az 5’-foszfátcsoportokat jelzi. 3. A kezelt pThal és LE' (d) fragmens reakciója A pThal plazmid tartalmaz egy ampicillin rezisztenciát meghatározó gént, és a timozinal fehérjét meghatározó strukturgént az EcoRI helyen az 5’-kódoló szálvégen és a 3’-végen egy BamHI helyen. A timozin gén tartalmaz továbbá egy BglII helyet is. Az LE’ (d) fentiek szerint előállított fragmensét befogadni képes plazmid előállítására a pThal plazm időt EcoRI enzimmel kezeljük, majd dTTP és dATP jelenlétében Klenow polimeráz I enzimmel reagáltatjuk az EcoRI végek tompa végekké alakítására. A kapott termék BglII emésztését követően olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmcnst kapunk, amely tartalmazza az ampicillin rezisztencia gént, és az ellenkező végen egy ragadós BglII helyet és egy tompa véget. A kapott termék LE’ (d) fragmcnssel, amely BglII ragadós véget és egy tompa véget hordoz, recirkulálható T4 ligáz katalitikus hatásával. Ekkor megkapjuk a pTrp24 plazm időt. A tompa végligáció helyén EcoRI hely jön létre. E) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása A pTrp24 plazmidot BglII, majd EcoRI enzimmel hasítjuk, és ezt követően poliakril-amid gél-elektroforézist és elcktro-eluciót végzünk. Ily módon olyan fragmenst kapunk, amely tartalmaz LE’ (d) polipeplidet meghatározó kodonokat, és BglII ragadós véget, és egy EcoRI ragadós véget a 3’-kódoló vég szomszédságában. Az LE’ (d) fragmenst a pSOM7A2 plazmid BglII helyére klónozhatjuk, amikor a triptofán promoter-operátor rendszer szabályozása alatt álló, kifejeződő LE ’ pol ipcplid/szomatosztatin fúziós proteint kapunk. Úgy járunk cl, hogy 1. a pSOM7A2 plazmidot EcoRI enzimmel részlegesen emésztjük, amikor hasad a triptofán promoter/operátor rendszertől távolabb cső EcoRI hely, majd 2. a primer szekvenciát megfelelően megválasztva, elérjük, hogy a kodon leolvasási fázisa megfelelő maradjon, és hogy újra létrejöjjön az EcoRI hasítási hely. Részletesebben szólva, úgy járunk el, hogy 16 pg pSOM7A2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 0,5 egység EcoRI enzimmel hasítunk az alábbi, 200 pl térfogatú pufferban: 20 mM írisz, pH = 7,5, 5 mM magnéziumklorid, 0,02% NP40 detergens és 100 mM nátrium-klorid. A reakciót 15 percen át végezzük 37 °C hőmérsékleten, majd fenollal, ezt követően klorofommal extraháljuk az clcgyel, a terméket ctanollal kicsapjuk, és ezután BglII enzimmel emésztjük. A kapott nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elcktroforézist követően elcklroclucióval izoláljuk. A fragmens tartalmazza az LE’ polipeptid proximális végét meghatározó [LE’ (p)] kodonokat, azaz azokat, amelyek a BglII helytől balra esnek. A fragmenst ezután a fenti LE’ (d) fragmcnssel ligáljuk T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, amikor megkapjuk a pSOM7A2A4 plazmidot. A plazmiddal E. coli 294 sejteket transzformálunk, a transzformánsok hatásosan termelik azt a fúziós proteint, amely áll a teljes LE polipeptidből és a szomalosztatinból. A kifejeződés a triptofán promoter/operálor rendszer szabályozása alatt áll. F) A 3’-végen PslI helyet, az 5’-végen BglII helyet hordozó, tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása A pBR322 plazmidot HindlII enzimmel hasítjuk, és a ragadós HindlII végeket SÍ nukleázzal kezeljük. Az SÍ nuklcázos kezelést úgy végezzük, hogy 10 pg HindlII enzimmel hasított pBR322 dezoxi-ribonuklcinsavat 30 pl alábbi összetételű pufferban, 300 egység SÍ nukleázzal hasítunk 30 percen át, 15 °C hőmérsékleten: 0,3 M náPium-klorid, 1 mM cink-klorid, 25 mM nátrium-acctát, pH = 4,5. A reakció leállítására 1 pl 30X S1 nuklcáz reakciót leállító oldatot adagolunk. Ennek összetétele a következő: 0,8 M trisz-bázis és 50 mM etilén-diamin-tetraccetsav. Az elegyet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, ctanollal kicsapjuk, és a terméket EcoRI enzimmel emésztjük, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A kapott fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézist követő elektno-elucióval izoláljuk. A termék EcoRI ragadós véggel és egy tompa vég-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
