202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen

11

HU 202 585 B

12

I. táblázat

A thimozinal gén előállításakor használt szintetikus oligonukleotidok \

Vegyi*

let

Szekvencia

Hosz'SZÚ-ság

HPLC

analízis

retenciós

idő

(perc*)

T,

A-A-T-T-C-A-T-G-T-C

10

17,4

T2

T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A

15

24,3

t3

T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A

12

20,3

t4

G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A

13

22,0

t5

G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G

15

24,8

t6

G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A

12

20,1

t7

A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A

13

22,6

t8

A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T

12

20,2

t9

G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G

12

20,4

T10

A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T

12

21,1

Tu

G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T

12

20,5

t12

G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G

12

20,4

T13

C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T

12

19,9

T„

T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C

12

20,5

T„

G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C

12

20,2

Tj6

G-A-T-C-C-T-A-T-T-A

10

17,2

X =

szobahőmérsékleten.

A fenti szintézist a Ti5-fragmens előállítása kapcsán ismertetjük, és a mellékelt 8. ábrán foglaljuk össze. AT15-fragmens szintézisekor használt különböző nukleotidokat az ábrán számmal jelöljük. A rövidítések a következő jelentésiek:

TPSTe: 2,4,6-triizo-propil-bcnzol-szulfonil-tetrazol;

BSA: bcnzol-szulfonsav;

TLC: vékonyréteg-kromalográfia;

HPLC: nagyfelbontású folyadékkromatográfia;

DMT: 4,4’-dimctoxi-tritil-csoport;

CE: 2-ciano-etil-csoport;

R: p-klór-fenil-csoport;

Bz: benzoilcsoport;

An: anizoilcsoport;

iBu: izobutirilcsoport;

Pi: piridin;

AcOH: ecetsav;

Et3N: trietil-amin.

85 mg (0,05 mmól) teljesen védett 4 tridezoxi-ribonukleotidot és 180 mg (0,1 mmól) 2-t védőcsoporttal látunk el az 5’-hidroxil-csoportokon oly módon, hogy kloroform és metanol 7:3 térfogatarányú elegyében 2% BSA-val (bovin szérumalbumin) kezeljük, 10 percen át, 0 ’C hőmérsékleten.

Areakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonát 2 ml-ét adagoljuk, az elegyet 25 ml kloroformmal extraháljuk, és 2 x 10 ml vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázist magnézium-szulfáttal vízmentesítjük, 5 ml térfogatúra töményítjük és petrolétcrrel (35 'C - 60 *C hőmérsékleten forró frakció) kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk sorrendben a 6 és 8 vegyületeket. A terméket a szilikagélen

(Merck 60 F254) kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyével végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogének.

270 mg (0,15 mmól) 1 és 145 mg (0,075 mmól) 3 trimert az 5, illetve 7 foszfo-diészterckké alakítunk át oly módon, hogy 25 percen át, szobahőmérsékleten trietil-amin, piridin és víz 1 : 3 : 1 térfogatarányú elegyénck 10 ml-ével kezelünk. A reagenseket forgó desztillátorban távolítjuk el, és a desztillációs maradékokat 3 x 10 ml vízmentes piridinnel végzett, ismételt desztillációkkal szárítjuk. 0,05 mmól 8 trimert és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól) 2,4,6-triizo-propil-bcnzol-szulfonil-tetrazollal elegyítünk, és a reakcióelegyet 2 órán át csökkentett nyomású térben hagyjuk szobahőmérsékleten. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a 8 trimer 95%-a hexamer termékké alakult (úgy vizsgáljuk, hogy a 4,4’-dimetoxi-tritil-csoportokat 10%-os, vizes kénsavval reagáltatjuk és 60 "C hőmérsékleten hevítjük). A reakciót 1 ml víz adagolásával leállítjuk, és az oldószert csökkentett nyomású térben desztillálva eltávolítjuk. Toluollal való együttes desztillációval eltávolítjuk a piridint, és a hexamert az 5’-hclyzetben védőcsoport-hasítjuk 8 ml 2% benzol-szulfonsavval, ahogy azt a 4 és 2 trimerek esetén megadtuk. A 10 terméket szilikagél oszlopon (Merck 60 H, 3,5 x 5 cm) tisztítjuk, kloroform és metanol 98:2-95:5 térfogatarányú elegycivel végzett szakaszos gradiens elucióval. A 10 terméket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk.

Az 5 trimert hasonlóképpen összekapcsoljuk a 6 vegyülcttel, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Az utóbbi vegyületet 3’-végein védőcsoport-hasítjuk az előzőekben megadottak szerint eljárva, trietil-amin, pridin és víz elegyével. Ily módon megkapjuk a 9 fragmenst.

Végül a 9 és 10 hexamereket 2 ml vízmentes piridinben kapcsoljuk 75 mg (0,225 mmól) 2,4,6-triizo-propil-benzol-szulfonil-tetrazollal, mint kondenzálószerrel. A reakció szobahőmérsékleten 4 óra alatt teljessé válik, ezután az elegyet rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélen kromatografáljuk. Petroléteres kicsapással 160 mg 11 terméket kapunk, ez a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 0,5 ml piridinben 20 mg 11 vegyületet oldunk, és 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal kezeljük 8 órán át, 60 *C hőmérsékleten, a védőcsoportok teljes hasítására. Ezután 80%-os ecetsav-oldattal kezeljük, 15 percen át, szobahőmérsékleten. Az ecetsavat desztillációval eltávolítjuk, és a szilárd halmazállapotú desztillációs maradékot 4 ml 4%-os, vizes ammónium-hidroxidban oldjuk, az oldatot 3 x 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményítjük, és egy részét a kapott 12 vegyület tisztítására nagyfelbontású folyadékkromatográffal frakcionáljuk. A nagyobb csúcsnak megfelelő frakciókat összegyűjtjük (2 O.D.^ egység), és 5 ml térfogatúra töményítjük. A végső 12 terméket sómentesítjük 1,5 x 100 cm méretű Bio-gel P-2 oszlopon, az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. A frakciókat szárazra desztilláljuk és 200 pl vízben szuszpendáljuk, a kapott oldat jellemzője: Á254 = 10. A 12 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvenciaanalízissel bizonyítjuk.

A teljes thimozinal gént a 16 szintetikus oligonukleotidból állítjuk össze az irodalomban a szomatosztatin kapcsán részletesen leírt módszert használva [llakura és munkatársai (1977)]; ezzel a módszerrel állították elő

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7