202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
9 HU 202 583 B 10 3. példa Citomegalovírus DNS kimutatása klinikai mintákból, befogó próbákat alkalmazva módosított printerekként. Ebben a példában a módszer alkalmazhatóságát mutatjuk be klinikai mintáknál, CMV-t detektálva olyan gyermek vizeletéből, akiről ismert, hogy citomegalovírus fertőzésben szenved. Egy egészséges gyermektől származó minta szerepel kontrollként. Mindkét vizeletminta mennyisége 10 ml, melyből az össz-DNS-t Virtancn és munkatársai módszerével izoláljuk [J. Clin. Microbiol., 20 (6), 1083-1088 (1984)]. A DNS-eket 20 pl vízben oldjuk, majd cél-nuklcinsavként használjuk a 2. példában leírt módon végrehajtott reakciókban. A10 DNS-szintézis ciklus után a jelzett szelektív próbát hozzáadjuk a mintához, hagyjuk hidridizálni, majd a hibrideket összegyűjtjük. A beteg vizeletéből származó DNS tisztán mutatta a megnövekedett radioaktivitást a hibridekben, míg az egészséges személytől származó csak háttér radioaktivitást mutatott Az aktuális cpm értékek 2300 és 240. 4. példa A Semliki Forest vírus RNS kimutatása, befogó próbákat használva módosított primerként. A 4. példa célja az, hogy demonstrálja, hogy a leírt módszer alkalmas RNS kimutatására is. A használt modell a Semliki Forest Vírusból (SFV) származó RNS. A használt reagensek: két 5’ végen biotinilezctt befogó primer P„ Pb (SFV cDNS) (2. ábra) (a 2. példában leírt módon készítve), egyetlen 5’ végén 32P-vel jelzett szelektív detektor próba (az 1. példában leírt módon készítve), reverz transzkriptáz. (Promega Biotech.) és DNS-polimeráz, Klcnow fragment (Boehringer Mannheim). Az SFV-RNS kimutatásának első lépése cDNS másolat készítése. A 20 pl-es reakcióelegy összetétele: 10 mM Tris-HCl CpH 8,3) 50 mM KC1,10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM mindegyik dezoxinukleotid-trifoszfátból, 0,5 pg t-RNS, 10 pg SFV-RNS, 10 pmol Pa befogó primer és 100 egység reverz transzkriptáz. Ezt az elegyet inkubáljuk 37 °C-on 15 percig. Az elegyet ezután 5 percig 100 'C-on tartjuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Ezután 50 pl-t adunk hozzá a következő összetételű oldatból: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 10 pmol Pb befogó próba és 0,5 mM mindegyik dezoxinukleotid-trifoszfátból. A hőmérsékletet 37 'C-ra emeljük, majd 5 perc elteltével 1 egység DNS-polimerázt adunk az elegyhez. További 10 perces inkubálás után a reakció-elegyet 5 percig 100 °C-on tartjuk, lehűtjük 37 "C-ra és 5 DNS-szintézis ciklust hajtunk végre. Egy végső denaturálási lépés után 0,1 pmol (1,2 x 10* cpm) szelektív próbát adunk az elegyhez 80 pl a következő összetételű oldatban: 1 M NaCl, 50 mMEDTA, 50 mM nátriumfoszfát (pH 7,5) és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát. Az oldatot ezután két órán át 55 "C-on inkubáljuk, majd a hibrideket az 1. példában leírt módon összegyűjtjük és mossuk. Negatív kontrollként a reakciót egy azonos mintán is elvégezzük, azzal a különbséggel, hogy reverz transzkriptázt nem adunk az elegyhez. Abban a mintában, amelyben az RNS-t reverz transzkriptázzal cDNS-sé alakítjuk, a befogott hibridek 420 cpm 32P aktivitást eredményeznek, míg a negatív kontroll 50 cpm-L 5. példa A multiplikált DNS különböző kimutatási módjainak összehasonlítása. Ebben a példában a multiplikált DNS három különböző kimutatási módját hasonlítjuk össze. A reagens és a sokszorozási eljárás ugyanaz, mint az 1., illetve 2. példában, azzal a kivétellel, hogy a szelektív befogó vagy detektor próbák Ml 3 kiónok, melyek körülbelül 100 nukleotidot ismernek fel a primerek között. Az M13 kiónokat a pBR 322/CMV Hindffl L rekombináns plazmidból származó HaelII restrikciós fragmenteket M13 mp 10 fágvektorba klónozva állítjuk elő, ismert módszerekkel. A szelektív befogó próbaként hozzáadandó M13 kiónokat biotinnal módosítjuk, photoprobeTM biotint alkalmazva (Vector Laboratories). A szelektív detektor próbaként hozzáadandó Ml3 kiónokat 32P-dCTP-vel jelöljük, polimeráz I-et (Klenow fragment) és primer kiterjesztést használva (Hu and Messing, Gene, 17,271-277 (1982),) 2x10* cpm/pg specifikus aktivitást érve így el. A linearizált pBR322/CMV Hindin Lplazmid 3 x 105 molekulájának (0,5 x lfr18 mól) sokszorozását 10 ciklusban hajtjuk végre. Az 1. és 2. módszer szerinti detektálás céljára a P, és Pb, 32P-vei jelzett detektor primerekből 2-2 pmolt használunk, és a sokszorozási eljárást az 1. példában leírt módon hajtjuk végre. A 3. módszer szerinti detektáláshoz a sokszorozó eljárásban 25 pmol biotinilezett befogó próbát használunk és a reakciót a 2. példában leírt módon hajtjuk végre. 1. Detektálási módszer - szelektív befogó próba használata a cél-nukleinsav másolataival oldatban keletkezett hibridek összegyűjtésére. Ennél a detektálási módszernél biotinilezett szelektív Ml3 befogó próbát használunk a sokszorozódott DNS fragmentek összegyűjtésére. Az utolsó sokszorozási ciklus után a mintát 100 'C-ra melegítjük és mindegyik biotinilezett szelektív befogó próbából 2 x 109 molekulát adunk hozzá, valamint NaCl-t (0,6 M), EDTA-t (5 mM), nátrium-foszfátot (20 mM) és SDS-t (0,1%). A térfogat 100 (il-re nő, és a végkoncentrációkat adjuk meg. Az elegyet 65 'C-on tartjuk 2 órán áL A keletkezett hibrideket az 1. példában leírt módon streptavidin agarózon gyűjtjük össze, azzal az eltéréssel, hogy két további mosást végzünk 50 "C-on a következő összetételű oldattal: 15 mM NaCl, 1,5 mM nátrium-citrát, 0,2% SDS. Az összegyűjtött hibridek radioaktivitását mérjük. 2. Detektálási módszer - A szelektív befogó próba immobilizálása, mielőtt a cél-nukleinsav másolataival hibridizálódik. Ebben az esetben immobilizált szelektív M13 próbákat használunk a sokszorozódott DNS befogására. Az utolsó sokszorozási ciklus után a mintákat 100 'C-ra melegítjük. Hozzáadunk NaCl-t (0,6 M), nátrium-citrátot (60 mM), Ficoll-t (0,02%), polivinilpinolidont (0,02%), borjú szérum albumint (0,02%) és denaturált hering-sperma DNS-t (0,2 mg/ml). A jelzett koncentrációk 100 pl végtérfogatra, vonatkoznak. Minden egyes mintához egy nitrocellulóz szűrőkorongot adunk, amelyhez a szelektív próbákból 5 x 1010 molekulát rögzítünk egy korábban leírt eljárás szerint (lásd 4 486 539 sz. amerikai szabadalmi leírást). A keveréket a szűrőkkel 65 *C-on inkubáljuk 2 óráig vagy 18 óráig. A hibridizációs reakció után a szűrőket kétszer mossuk 50 *C- on a következő összetételű oldattal: 15 mM NaCl, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
