202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
11 HU 202 583 B 12 1,5 mM nátrium-citrát és 0,2% SDS, és a szűrökhöz kötött radioaktivitást megméijük. 3. Detektálási módszer - Szelektív detektor próba használata kimutatáshoz. Itt a sokszorozott DNS kimutatására 32P-vel jelzett szelektív Ml 3 detektor próbákat használunk, és a hibrideket a 2. példában leírt módon az 5’ végükön biotinilezettbefogó primerek segítségével gyűjtjük össze. A sokszorozott mintákat 100 'C-ra melegítjük és 32P-vel jelzett szelektív próbákból 2x10® molekulát (2 x 105 cpm) adunk hozzájuk, az 1 módszernél leírt sókkal együtt. A hibridizálást és a keletkezett hibridek összegyűjtését az 1. módszerben leírtak szerint végezzük. A három detektálási módszerrel kapott eredmények összehasonlítását a 3. táblázatban mutatjuk be. Az 1. és 3. detektálási módszernek az az előnye, hogy a hibridizálás sebessége oldatban gyorsabb, mint a szűrő-hibridizációnak a 2. detektálási módszernél. A legmagasabb 32P aktivitást a 3. módszerrel kapjuk, mivel a szelektív detektor próba több 32P atomot tartalmaz molekulánként. 3. táblázat Mód Primerek Szelektív Hibridi-32P akti-M13 próba zációs vitás idő ahibri(óra) dekben (cpm) (a) 1 32P-vel jelzett biotinilezett 2 870 detektor befogó 2 ^P-vel jelzett rögzített 2 43 detektor befogó 18 920 3 biotinilezett 32P-vel 2 7800 befogó jelzett detektor (a) Három meghatározás átlaga (cpm a háttér fölött) 6. példa Citomegalovírus DNS sokszoiozása biotinilezett detektor primerekkel és indirekt kimutatás streptavidintormaperoxidázzal. Ebben a példában a CMV specifikus plazmid (pBR322/CMV HindlII L) sokszorozását végezzük el a 2. példában leírt P. és Pb biotinilezett primerekkel mint detektor-primerekkel. Az 5. példában leírt Ml 3 kiónokat szulfon-csoportokkal módosítva használtuk szelektív befogó próbaként. A keletkezett hibrideket szulfonmódosított DNS-t felismerő antitestekkel borított mikrotiter-lyukakban gyűjtjük össze. A keletkezett hibridek végső kimutatását streptavidin-tormaperoxidáz konjugátummal végezzük, amely detektálja a primerek biotin egységeit. Az M13 kiónokat szulfonálási reakcióval módosítjuk, olyan reagensekkel, amelyeket az Orgenics Ltd (Yavne, Israel) által javasolt eljárásban használnak. Poliszűrői mikrotiter lemezeket (Nunc, Dánia) bontunk 10 ftg/ml IgG-vel, amelyet szulfon-módosított DNS-sel (Orgenics Ltd) szembeni monoklonális antitestből tisztítunk, 10 mM nátrium-karbonát pufferben (pH 9,6), éjszakán át 4 *C-on. Egy reakcióelegyet, amely a linearizált pBR 322/CMV HindlII L plazmidból 3 x 105 molekulát, vagy a plazmid nélküli kontiollokat, valamint a biotinilezett P„ Pb primerek mindegyikéből 25-25 pmol-t tartalmaz, az 1. példában leírt körülmények között 10 sokszorozási ciklusba visszük. A mintákat 100 *C-ra, melegítjük, ezután a szulfonált szelektív befogó próbák mindegyikéből 2 x 106 * * 9 molekulát adunk hozzá, az 5. példában található 1. detektálási módban használt reagensekkel együtt. Az elegyet 65 *C-on 2 órán át inkubáljuk, 100 pl 0,2%-os Tween 20-szal hígítjuk, majd a beborított mikrotiter lemezekre visszük. A hibrideket két órán át 37 *C-on tartva hagyjuk a lemezek falához kötni. A reakcióelegyet elöntjük és a lemezeket háromszor mossuk 0,1% Tween 20-szal a következő összetételű oldatban: 0,15 M nátrium-klorid, 20 mM nátrium-foszfát (pH 7,5) (PBS). 200 pl streptavidin-tormaperoxidáz konjugátumot (Amersham, UK) kétezerszeresre hígítunk 1% borjú szérum albumint, 0,1% Tween 20-t tartalmazó PBS oldatban, ezt hozzáadjuk a lemezen lévő mintákhoz és 45 percig 37 "C-on inkubáljuk. Négy, a fentiekben ismertetett mosás után 200 pl szubsztrát-oldatot adunk hozzá, amelynek összetétele a következő: 0,46 mg/ml O-fenilén-diamin, 0,01% hidrogén-peroxid 0,1 M nátrium-acetát pufferben (pH 5,0). 15 perces 22 *C-os inkubálás után 50 pl 2N kénsav hozzáadásával leállítjuk a reakciót, és a színes termék elnyelését spektrofotométerrel mérjük 492 nm-en. Az összegyűjtési és kimutatási eljárásokat már korábban leírták (Syvänen et al, Nucleic Acids Res., 14,5037-5048 (1986)). A kísérlet eredményeit a 4. táblázatban mutatjuk be. A kiválasztott plazmidból 3 x 105 molekulát (0,5 x 10~18 mól) tísztán ki lehet mutatni 10 sokszorozási ciklus után. 4. táblázat A cél mennyisége (mól) Abszorpció 492 nm-en (a) 0,5 x 10-18 0,348 0 0,120 (a) Három mérés átlaga 7. példa Az I-es típusú HÍV vírus kimutatása befogó próbákat alkalmazva módosított primerkénL Ebben a példában a módszer klinikai minták vizsgálatára való alkalmazhatóságát igazoljuk HIV-1 kimutatásával 5 HÍV-vei fertőzött személyből, valamint 4, HI V- veszélynek kitett személyből. A limfocita DNS-t Bell és munkatársai szerint izoláljuk [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78,5759-5763 (1981)], és az egyes ampilifikálási reakciókban 1 pg DNS-t használunk. A pozitív kontrollként használt HIV-1 templát egy 1,8 kb méretű DNS szegment a HIV-1 genom gag régiójából, amelyet egy expressziós vektorba klónoztak [Jalanko et al., Biochimica et Biophysica Acta, 949, 206- 212 (1988)]. A HIV-1 kimutatására használt indító molekulák és a próba a gag génben levő konzervált régióból származik. Az SK 38 primert biotinileztük és befogó primerként használtuk, a detektor próba a primerek közötti 41 bp méretű régióval komplementer. A primerek és a próbák 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
