202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
7 HU 202 583 B 8 amely a citomegalovírus (CMV, AD 169, ATCC VR- 538) genomból egy 12.3 kb méretű fragmentet tartalmaz. A két használt detektor primer (P„ Pb, 1. ábra) 20 nukleotid hosszúságú és standard módszerekkel készültek egy automata DNS-szintetizátoron. Ezek megfelelnek a CMV-DNS két, egymástól 111 nukleotid távolságra lévó szakaszának. A két szelektív befogó próba (S^ S2,1 ■ ábra) a két detektor primer közötti szakaszon, a két szálon jelenlévő régiókat ismeri fel. A P, és Pb detektor prímeteket az 5’ végükön 32P-vel jelöltük 4 x 109 CPM/ttg specifikus aktivitással, a jól ismert, polinukleotid-kináz és gamma -32P-ATP között lezajló reakciót alkalmazva [Maniatis et al„ Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)]. ' Biotinilezett nukleotidokat adunk a befogó próbák 3’ végéhez, bio-11-dUTP-t (BRL) és terminális transzferázt (Promega Biotech.) alkalmazva, amint azt Rilly és munkatársai közölték [DNA, 5 (4), 333-337 (1986)]. A cél-plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítva linearízáljuk. A DNS-polimcráz, Klenow-fragment Boehringer-Mannheim, a streptavidin-agaróz BRL gyártmány. Ezeknek a reagenseknek a felhasználásával a következő kísérletet hajtjuk végre. Négy reakcióelegyet rakunk össze, melyek 0,104, 106 és 10* molekulát (azaz 0,2 x 10-20,2 x 1018 és 2 x 10~16 mólt) tartalmaznak a kiválasztott plazmidból. Emellett a négy reakcióelegy 50 pJ össztérfogatban tartalmaz még a két primer mindegyikéből 2-2 pmol-t, a négy dezoxinukleotid trifoszfátból (azaz dATP, dCTP, dGTP és dTTP) 0,5-0,5 mM-t, 10 mM Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mM MgCl2-t, 50 mM NaCl-t és 10 mM ditiotrcitolt. Az elegyet két percig 100 °C-on tartjuk, majd 5 percig 37 *C-on inkubáljuk, miután 1 pl (megfelel 1 egységnek) DNS-polimerázt adunk hozzá. A forralást követően a detektor primerek a helyükre kapcsolódnak, majd a hozzáadott DNS-polimerázzal 37 *C-on DNS-szintctizáló ciklus jön létre. Ebben a kísérletben a ciklust vagy egyszer hagyjuk lefutni, vagy ismételjük 5-15 alkalommal. Az utolsó ciklus után a mintát ismét 100 *C-ra melegítjük, majd 10 pmol szelektív befogó próbát adunk hozzá, NaCl-dal (0,9 M), EDTA-val (20 mM), nátrium-foszfáttal (pH 7,5; 20 mM) és nátrium-dodccil-szulfáttal (0,1%) együtt. A térfogat 100 pl-re nő, az adott koncentráció értékek a vég-koncentrációt mutatják. Az elegyet egy órán át 50 'C-on inkubáljuk. Ezután a hidrizációs reakció után 200 pl streptavidin-agaróz 1M NaCl-os szuszpenziót adunk hozzá, majd 20 mM nátrium-foszfátot (pH 7,5) és 1 mM EDTA-t. A biotinilezett molekulákat hagyjuk hozzákötni a streptavidin-agarózhoz, 15 percig 37 ’C-on forgó keverőben inkubálva az elegyet. Az agarózt rövid centrifugálással leülepítjük és a felülúszót leszívatjuk. Az agarózt ezután egyszer mossuk a fenti pufferolt (pH 7,5) 1 M NaCl-dal és 37 *C-on kétszer mossuk egy 150 mM NaCl-t, 15 mM nátrium-citrátot és 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot (pH 8) tartalmazó oldattal. Az agaróz radioaktivitását, amelyhez a keletkezett hibridek kapcsolódnak, radioaktivitás-mérő berendezésben megmérjük. A biotinilezett markert tartalmazó DNS-hibridek kinyerési és mosási eljárása a 2 169 403 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásból már korábban ismert. A kísérlet eredményét az 1. táblázatban mutatjuk be. Látszik, hogy a DNS-szintézis egy ciklusa során csak akkor épül be elég radioaktivitás a detektáláshoz, ha cél-molekula magas koncentrációban van jelen, de még a nagyon alacsony koncentrációjú célmolekula is detektálható 15 ciklus után. Magas cél-molekula koncentráció és 15 ciklus esetén a detektor primer mennyisége csökkenthető. 1. táblázat A cél-molekulák A 32P aktivitás az összegyűjtött mennyisége (mól) hibridekben^ (CPM a háttér felett)^ 1 5 15 ciklusok száma 0 0 0 0 2 x KL20 ND ND 650 2 x KL1* ND 300 11 000 2 x 10-16 700 13 000 36000 (a) kél meghatározás átlaga (b) ND - nem detektálható (kisebb radioaktivitás mint a háttér átlagának kétszerese). 2. példa Citomegalovírus DNS meghatározása módosított printerként befogó próbákat használva. Ebben a példában biotinilezett befogó próbák szerepelnek printerként. Az alkalmazott reagensek ugyancsak mint az 1. példában, a következő különbségekkel: A befogó primereket (P„ Pb, 1. ábra) nem jelöljük 32P- vel, hanem az 5’ végeket módosítjuk úgy, hogy biotincsoportot tartalmazzanak. Ezt a kémiai módosítást ismert módszerekkel végezzük (Chollet and Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, 1529-1541 (1985). A két szelektív próbát (S! és S2,1. ábra) ebben az esetben az 5’ végükön jelöljük, hogy detektor próbaként használhatók legyenek. Specifikus aktivitásuk körülbelül 2 x 109 és 2,5 x 109 cpm/p.g. A reakcióelegyet az 1. példában leírt módon állítjuk össze. A biotinilezett P„ Pb befogó primereket azonban 10-szeres mennyiségben adjuk hozzá, azaz 20 pmol-t mindegyik reakcióhoz. 1,5 vagy 15 ciklust hajtunk végre a leírás szerint, majd a mintákat 100 *C-ra melegítjük és a 32P-vel jelzett St és S2 próbákból 0,5-0,5 pmol-t adunk hozzá. A hibridizálást az 1. példában leírt körülmények közöu hajtjuk végre. A hibrideket ezután a streptavidin-agarózon gyűjtjük össze, mint az 1. példában. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 2. táblázat 32 A cél-molekulák A P aktivitás az összegyűjtött mennyisége (mól) hibridekben^ (CPM a háttá- felett)^ 1 5 15 ciklusok száma 0 0 0 0 2XKL20 ND ND 800 2 x IO“18 ND 400 13 000 2x IO“16 300 11 000 54 000 (a) két meghatározás átlaga (b) ND - nem detektálható (kisebb radioaktivitás mint a háttér átlagának kétszerese). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
