202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
5 HU 201 583 B 6 ban tartalmaz egy multikonténer egységet, amelyben a fent említett reagens-kombinációk egyikét kombinálják a következő reaktánsokkal és a teszthez szükséges eszközökkel, azaz a kit tartalmaz egy konténert, melyben legalább egy templát-függő polimerizáló ágens található, egy konténert a négy dezoxinukleotid-trifoszfáttal, egy megfelelő eszközt a polimerizációhoz és a hibridizációhoz, egy megfelelő eszközt a cél-nukleinsavról készült másolatok elválasztására, és egy megfelelő eszközt a jelzés vizsgálatára. Az előnyös eszközöket és reaktánsokat a leírás következő részében újuk le részletesebben. A találmány szerinti eljárás kivitelezése A találmány szerinti előnyös eljárás azzal kezdődik, hogy legalább két módosított primert (mindkét primer vagy detektor vagy befogó primer) adunk egy denaturált minta-oldathoz. A módosított primerek mindegyike a cél-nukleinsavon lévő, nekik megfelelő komplementer szálhoz, azaz a templálhoz kapcsolódik, és egy templátfüggő nukleinsav-szintetizáló enzim hozzáadására a primerek meghosszabbodnak. Az eljárás jól működik, in vitro új nukleinsav szálak keletkeznek, amelyek néhány ezer bázis hosszúak is lehetnek, azzal a feltétellel, hogy a körülmények megfelelők. Fölöslegben alkalmazva a módosított printereket, az eljárás megismételhető, így az újonnan szintetizált szálakhoz komplementer másolatok készíthetők, melyek így az első templáttal azonos másolatok. Ezt az eljárást ismételve egy kaszkád reakciót indíthatunk be, amely során a cél-nukleinsav megsokszorozódik. Az eljárást annyiszor lehet ismételni, ahányszor csak akarjuk, hogy a kívánt detektálási érzékenységet elérjük. Abban az esetben, mikor a cél-nukleinsav koncentrációja nem túl alacsony, egyszeri sokszorozás elég ahhoz, hogy a célnukleinsavat kimutathatóvá tegyük. Az A lehetséges, hogy csak egy módosított primert használhatunk a találmány szerinti módszerben. Ebben az esetben azonban a sokszorozás nem olyan hatékony, mint amikor legalább két primert alkalmazunk, mivel a reakció nem kaszkád-típusú reakció. Mind a DNS-t, mind RNS-t meg lehet határozni a jelen találmány szerinti módszerrel. Azonban ha a célnukleinsav RNS, akkor a legegyszerűbb először az RNS-t reverz tmaszkriptáz enzimmel a megfelelő cDNS-sé átírni, ezután az eljárás a fentiek szerint folytatódik. Miután a módosított primerek beépültek a cél-nukleinsavak másolataiba, a reakció-elegyhez a cél-szekvenciát és másolatait felismerő megfelelő szelekü'v próbát adunk, és a hibridizációs reakciót a választott hibridizációs eljárásnak megfelelő körülmények között végezzük. A hibridizációs reakcióban, a választott módosított printertől függően vagy egy szelekü'v befogó próbát vagy szelekü'v detektor próbát hibridizálunk a cél-nukleinsavról készült másolatokkal, amelyek az eredetileg jelenlévő cél-nukleinsavhoz viszonyítva már sokszoros mennyiségben vannak jelen. Ha az eredeti minta tartalmazza a kiválasztott szekvenciát, akkor a hozzáadott szelekü'v próba hibridizálódik a cél-nukleinsav újonnan szintetizálódott másolataival. Hibrid keletkezik a szelekü'v próba, valamint azon másolat molekulák között, amelyekbe a módosított primer beépült. A jelen találmány szerint keletkező hibrideket egyszerűen elválaszthatjuk a hibridizációs oldatból az affinitás-pár egyik eleme segítségével, amelyet vagy a befogó printerhez vagy a szelekü'v befogó próbához kapcsolunk. A frakcionálás során ezek a befogó egységet tartalmazó hibridek hozzátapadnak egy szilárd hordozóhoz az affinitás-pár másik elemének segítségével és a hordozóhoz tapadó szelekü'v detektor próba vagy detektor primer mennyiségét ismert módszerekkel mérhetjük közvetlenül a hordozón, vagy leoldás után az eluátumban. A jelzés mennyisége a mértéke a cél-nukleinsav mennyiségének. Frakcionálás előtt az oldatot meghígítjuk, ha szükséges, hogy a feltételek előnyösek legyenek az affinitáspár számára. Ezután az oldatot összehozzuk a szilárd hordozóval. A kérdéses hordozó lehet például egy affinitás kromatográfiás oszlop, egy szűrő, műanyag vagy üveg-felület. Az elválasztás végrehajtásához megfelelő eszközök a különböző típusú mikrotiter lemezek, szintmérő rendszerek vagy mágneses részecskék, de az elválasztást végrehajthatjuk kémcsövekben és üveggyöngyökön stb. Az affinitás-oszlop hordozó anyaga lehet természetes vagy szintetikus polimer, például cellulóz, poliakrilamid, polisztirol, dextrán vagy agaróz. Ezeket az anyagokat használhatjuk szuszpenzió formájában is, kémcsőben. Az is előnyös, ha olyan kémcsöveket használunk, amelyekben az affinitás-pár másik tagja a cső belső falához van kötve. Az anyag kiválasztásának előfeltétele, hogy hozzá lehessen kötni egy olyan komponenshez, amely affinitással rendelkezik az affinitás-pár másik eleméhez, amely elem hozzá van kapcsolva a befogó printerhez, vagy a szelektív befogó próbához. Az nem szükséges, hogy az affinitás-pár elemét vagy elemeit a polimerizáció kezdetén hozzákapcsoljuk a befogó printerhez. Az sem szükséges, hogy a detektálható jelzést a polimerizáció előtt kapcsoljuk hozzá a detektor printerhez. Ezeket a polimerizációs eljárás után is hozzáadhatjuk a cél-nukleinsav másolataiba beépült módosított printerhez. Például, ha a detektálható jelzés érzékeny a hibridizálás körülményeire, akkor ezt először a szelektív befogó próbának a cél-nukleinsav másolataival való hibridizálása után adhatjuk hozzá. Ha a detektor próbák a cél-nukleinsav másolataiba beépült módosított printerként szerepelnek, akkor a hibridet elválaszthatjuk a reakcióelegyből szilárd hordozón immobilizált szelekü'v befogó próbák segítségével. Ebben a módszerben, melyet a 237 362 számú európai közrebocsátási iratban is leírnak, a sebesség meghatározó lépés az, amikor a cél-nukleinsav, valamint másolatai, melyekbe a detektor primerek beépültek, hibridizálódnak a szilárd hordozón immobilizált szelektív befogó próbához. Emiatt az oldatban való hibridizálás előnyösebb módszer, mint a fenti eljárás. Ha azonban a módszernél immobilizált befogó próbát használunk, akkor a szilárd hordozón keletkező hibridet lemossuk és a hordozón lévő jelzés mennyiségét ismert módszerekkel mérjük. A vizsgálat elvét a következő példákon mutatjuk be. I. példa Citomegalovírus DNS kimutatása módosított printerként detektor próbákat használva. Ebben a modell-kísérletben a kimutatott cél-molekula egy rekombináns plazmid (pBR322/CMV Hindin L), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
