202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
3 HU 202 583 B 4 tátják azt az irányt, amerre meghosszabbodnak a polimerizáció során. A vizsgálati anyag előkészítése A módszerben használt próbák oligo- vagy polinukleotidok. A próbákat előállíthatjuk szintetikusan vagy félszintetikusan, amelyek a próba-előállításnak előnyös módjai, ha printerként is alkalmazzuk őket. Az is lehetséges, hogy a próbákat rekombináns technikákkal állítsuk elő, vagy közvetlenül a természetből izolált nukleinsavakból. A próbát megfelelő vektorhoz lehet kötni. Tartalmazhat vektor-részt, vagy teljesen mentes lehet a vektortól. Tulajdonképpen számos megfelelő, printerként, próbaként használható molekula kapható a kereskedelmi forgalomban. A detektor próbák mint módosított primerek A jelen találmány szerinti módszerek közül az egyikben a detektor próbák oligonukleotidok vagy polinukleotidok, melyek a cél-nukleinsavhoz bázis-párosodással kapcsolódnak, és amelyek printerként működnek egy templát függő nukleinsav-szintetizáló enzim számára. Fontos, hogy a detektor primerek legalább egy megfelelő, detektálható jelzést tartalmazzanak, vagy legalább egy specifikus helyet, ahova legalább egy megfelelő, kimutatható jelzést lehet kapcsolni. Különböző radioaktivitással jelzett vegyületeket használhatunk jelzésként. A jelző anyag lehet még fluoreszcens, lumineszcens, fénykibocsátó, enzimatikusan vagy immunológiailag kimutatható stb. Példaként megemlíthetjük azokat a jelzéseket, amelyek a biotin, valamint az avidin, illetve streptavidin, lantanida kelátok, ferritin és hem-vegyületek, valamint az immunológiailag demonstrálható haptének, úgymint az AAF és A1F (acetoxi-acetilfluorén származékok) közötti affinitáson alapszanak. Az azonosítás mediátorok, például fehérjék segítségével is lehetséges. A találmány szerinti módszer nem függ az alkalmazott jelzéstől. Minden jelenleg ismert nukleinsav hibridizációra alkalmas jelző vegyületet szabadon alkalmazhatjuk az eljárásban. Az azonban lényeges, hogy ha detektor próbák szerepelnek printerként, akkor a jelzést a jelzések olyan csoportjából kell választani, amely nem zavaija a primer működését A jelzést úgy kell hozzákapcsolni a detektor printerhez, hogy a nukleinsav polimerizáló enzim még príméiként ismerje fel. A befogó próbák mint módosított primerek A találmány szerinti másik eljárásban a befogó próbák olyan oligonukleotidok vagy polinukleotidok, melyek kötődhetnek a cél-nukleinsavhoz bázis-párosodás segítségével, és amelyek printerként szerepelhetnek egy templátfüggő nukleinsav-szintetizáló enzim számára. Lényeges, hogy a befogó primerek egy affinitás-párnak legalább az egyik megfelelő elemét tartalmazzák, vagy legalább egy specifikus helyet, ahová egy affinitás-párnak legalább egy megfelelő elemét lehessen kapcsolni. Az is lehetséges, hogy az affinitás-pár egységét vagy egységeit egy közvetítőn keresztül kapcsoljuk a befogó printerhez. A feltétel egyrészt az, hogy a hibridet a hibridizáló oldatból ki lehessen nyerni az affinitás-pár segítségével, valamint az, hogy a primer funkció ne sérüljön. Az affinitás-pár egyik egysége egy olyan komponens, amely affinitással rendelkezik, egy másik komponenshez. Például ilyen pár lehet a biotin - avidin vagy streptavidin, egy nehézfém származék-tio csoport, különböző homopolinukleotidok, úgymint poli dG- poli dC, poli dA- poli dT, poli dA- poli U, ilyen affinitás párok. De más komponens-párokat is lehet használni, azzal a feltétellel, hogy elég erős affinitással rendelkeznek ahhoz, hogy lehetővé tegyék a cél-nukleinsav másolataiba beépült módosított befogó primerek specifikus kötődését a szilárd hordozóhoz. Megfelelő affinitás-párok találhatók az immunológiai módszerekben használt ligandumok és konjugálumok között A szelektív befogó próba A jelen találmány szerinti eljárások közül az egyikben, ahol a detektor próbák szerepelnek príméiként, ott egy olyan szelektív befogó próbára van szükség, amely lehetővé teszi azoknak a cél-nukleinsav másolatoknak a szelektív elválasztását, melyekbe beépültek a módosított primerek. Lényeges, hogy a befogó próbák eléggé homológok legyenek a cél-nukleinsawal, hogy lehetővé tegyék specifikus hibridizációjukat a cél-nukleinsav másolataival, ezáltal a cél-nukleinsav másolataiba beépült detektor primerek szelektív elválasztását és detektálását A szelektív detektor próba A jelen találmány egy másik módszerében, ahol a befogó próbák szerepelnek módosított príméiként, egy szelektív detektor próbára van szükség, amely lehetővé teszi azoknak a cél-nukleinsavaknak a kimutatását, melyekbe a módosított primerek beépültek. Lényeges, hogy a detektor próba eléggé homológ legyen a cél-nukleinsavval ahhoz, hogy specifikusan hibridizálódjon és így szelektíve azonosítsa a cél-nukleinsavaL A detektor próbák báimely megfelelő, kimutatható próbát tartalmazhatnak, például azokat, melyeket a fentiekben említettünk. Reagens kombinációk A detektor próba m int módosított primer. A találmány tárgya olyan reagens kombináció, mely legalább egy módosítod prímért tartalmaz, amely legalább egy megfelelő kimutatható jelzést tartalmaz, vagy legalább egy specifikus helyet, ahova legalább egy megfelelő kimutatható jelzést lehet kapcsolni, valamint legalább egy szelektív befogó próbát, amely egy affinitás-párnak legalább egy egységét tartalmazza, vagy legalább egy specifikus helyet, ahová egy affinitás-párnak legalább egy egységét hozzá lehet kapcsolni. A befogó próba mint módosított primer A találmány tárgya továbbá olyan reagens-kombináció, amely legalább egy módosított prímért tartalmaz, amely legalább egy megfelelő egységét tartalmazza egy affinitás-párnak vagy legalább egy specifikus helyet, ahova egy affinitás-párnak legalább egy megfelelő egységét lehet csatolni, valamint legalább egy szelektív detektor próbát, amely legalább egy megfelelő kimutatható jelzést tartalmaz, vagy legalább egy specifikus helyet, ahova legalább egy megfelelő, kimutatható jelzést lehet kapcsolni. Kitek A jelen találmány leír még egy kényelmesen használható kit-et nukleinsavak vizsgálatára. A kit egy csomag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
