202583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás, reagenskombináció és KIT nukleinsavak vizsgálatára
1 HU 202 583 B 2 A találmány tárgya gyors és érzékeny eljárás nukleinsavak vizsgálatára és kimutatására hibridizációs technikával, ahol a detektor próbák a cél-nukleinsavról készült másolatokba a hidridizáció előtt beépült módosított indító (primer) molekulák, valamint kit erre a célra. A találmány tárgya továbbá eljárás nukleinsavak vizsgálatára hibridizációs technikával, ahol a befogó próbák a cél-nukleinsavról készült másolatokba a hibridizáció előtt beépült módosított indító molekulák, valamint reagenskészlet és kit erre a célra. A hibridizációs reakciókban egy jelzett oligo- vagy polinukleotid hibridizál bázisonként a kiválasztott nukleinsawal. Különböző hibridizációs módszereket használnak a nukleinsavak kimutatására. A direkt hibridizációs módszereknél a választott molekula lehet oldatban vagy szilárd hordozóhoz rögzítve. Az azonosítandó nukleinsavat egy jelzett próbával mutatják ki. A 4 486 539 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy szendvics hibridizálási módszert közölnek. Ebben az eljárásban két különböző próbát használnak, az egyik egy detektor próba, amely jelzett és a kimutatásra használják, a másik pedig egy szilárd hordozóhoz rögzített befogó próba, amely a kiválasztott nukleinsavnak a reakció-keverékből való elválasztására szolgál. Az oldatban végzett hibridizálás módszerét a 2 169 403 számú nagybritanniai szabadalmi leírásban ismertetik. Ennél a módszernél két különböző próbát használnak, mindegyiket ugyanabban a folyadék-fázisban. A detektor próbát egy kimutatható jelzéssel jelölik, és a befogó próbához kötik, amely utóbbi egy affinitáspár egyik tagja. A hibridizálás után a befogó próba, a cél-nukleinsav és a detektor próba között létrejött hibridet elválaszthatják a hibridizáló oldatból az affinitáspár másik tagja segítségével. A DNS enzimesen katalizált polimerizációja, mikor egy korábban már létező nukleinsav, azaz templát (minta) nukleotid sorrendje pontosan átmásolódik a komplementer szálba, jól ismert a szakirodalomban, lásd pl. Komberg, DNA replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 221-225 és 670-679 oldalak (1980), valamint Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 122. oldal (1982). Ezt a biológiai sokszorozódást használják a hibridizációs vizsgálatokban, mikor a kimutatandó mikroorganizmust szaporítják, így a DNS-ét a vizsgálat előtt feldúsítják. Leírása megtalálható például a Woo, Methods in Enzymology 68, 389 (1979), valamint a 4 358 535 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Specifikus DNS szekvenciákat is lehet sokszorozni az élő sejteken belül megfelelő anyagok használatával, amint azt Clewell és Helinski leírja (J. Bacteriol, 110, 1135 (1972), valamint az 55 742 számú európai közrebocsátási iratban. Egy specifikus DNS-dúsítást írnak le a 175 689 számú európai közrebocsátási iratban, ahol a célnukleinsavat egy plazmitl replikonhoz kötik és egy megfelelő sejtbe juttatják. Másik módszert közölnek a 201 184 számú európai közrebocsátási iratban, amelyben a DNS szintézis primer-függőségét használják olyan in vitro reakció konstruálására, amely a cél-DNS amplifikálódását eredményezi. A 200 362 számú európai közrebocsátási iratban a sokszorozott gének kimutatására javasolnak módszert. A jelen találmány tárgya érzékeny és könnyen végrehajtható módszer a hibridizáció oldatban való végrehajtására, azzal jellemezve, hogy a hibrideket könnyen és gyorsan eltávolíthatjuk a hibridizációs oldatból a hibridizációs reakció után. Ez úgy érhető el, hogy egy polimcrizációs reakcióban módosított detektor vagy befogó próbákat használunk azért, hogy a célmolekulát közvetlenül mérő módszerekhez viszonyítva több nagyságrenddel növeljük a hibridizációs reakció érzékenységét. A befogó próbák alkalmazásával egyébként a keletkezett hibridek a hibridizációs oldatból könnyen eltávolíthatók. A jelen találmány szerinti hibridizációs eljárásban a cél-nukleinsavat egy templát-függő polimerizációs eljárásban megsokszorozzuk, ahol vagy a detektor próba vagy a befogó próba szerepel módosított príméiként beépülve a cél-nukleinsavról készült másolatokba. A találmány szerinti eljárásban legalább egy printerre szükség van, és a printereket állandóan módosítjuk. Ha a detektor próba szerepel printerként a polimerizációs reakcióban, akkor a prímért legalább egy megfelelő kimutatható jellel (pl. radioaktív jelzés) látjuk el, vagy legalább egy specifikus helyet építünk be, amelyhez egy kimutatható csoport kapcsolható (pl. biotin csoport). Egy másik módszer szerint a befogó próbákat használhatjuk primerként a polimerizációs reakcióban, amely esetben a printerekbe egy affinitás-pár egyik alkalmas egységét építjük be, vagy legalább egy olyan helyet, amelyhez egy affinitás-párnak legalább egyik alkalmas egységét hozzákapcsolhatjuk. A találmány tárgya továbbá egy reagens kombináció és egy kit, amelyben becsomagolva több anyagot tároló egység van, ez tartalmazza a teszt kivitelezéséhez szükséges reagens-kombinációt. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy ha detektorvagy befogópróbákat alkalmazunk primerként egy polimerizációs reakcióban, úgy a hibridizációs reakciós érzékenységét több nagyságrenddel meg lehet növelni a cél-nukleinsavat közvetlenül mérő módszerekhez képest. A találmány továbbá egy kényelmes módszert ad a hibridizációs reakció oldatban történő végzésére úgy, hogy a hibrideket könnyen és gyorsan ki lehet nyerni a hibridizációs oldatból a hibridizációs reakció után. A találmány szerinti eljárás alkalmas bizonyos betegségek diagnosztizálására, olyanokéra, amelyeket nagyon nehéz kimutatni a szokványos módszerekkel. A módszer különösen jól használható a citomegalovírus és az SFV vagy AIDS-vírus azonosítására. Az l.és 2. ábrák rövid leírása Az 1. ábra bemutatja a módosított, P. és Pb primerek bázis-sorrendjét, az 1., 2. és 3. példákban használt szelektív, S! és S2 próbák bázis-sorrendjét, valamint a módosított P. és Pb primerek és az S! és S2 szelektív próbák relatív helyeit a kérdéses cél-nukleinsavon. A hosszú A és B vonalak mutatják a két cél szálat, amelyek mindkét irányban folytatódnak. A P, és Pb primereken lévő nyilak mutatják azt az irányt, amerre meghosszabbodnak a polimerizáció során. A 2. ábra bemutatja, a módosított P, és Pb primerek és a 4. példában használt szelektív próba, S, bázissorrendjét, valamint a módosított P, és Pb primerek és az S szelekü'v próba relatív helyeit a kérdéses cél-nukleinsavon. Az A vonal mutatja az RNS-t és az azzal azonos DNS-másolatot, a B vonal mutatja a komplementer DNS-másolatot. A P, és Pb primereken lévő nyilak mu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
