202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
9 HU 202 582 B 10 Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu- TGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG Glu-Thr-Tyr-Cys-Ala-Thr-Pro-Ala-Lys-Ser- GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG ICC Glu-COOH GAG-X Az előzőekben aláhúzással jelölt DNS-szekvencia és az ennek megfelelő aminosav-szekvencia az érett blGFII DNS illetve aminosav-szekvenciájával azonos, amint azt a jelen találmány céljai érdekében meghatároztuk. Amint a fenti bIGF-II prekurzor peptid szekvenciából látható, három lehetséges transzlációs kezdőpontjelző kodon (ATG) található az érett bIGF-II-t kódoló DNS szekvenciával azonos leolvasási keretben. Valószínűleg ezen ATG-k közül az első a valódi, működőképes startjele a bIGF-II prekurzor transzlációjának, bár lehetséges, hogy némely gazdasejtek a leolvasási keretben lévő alternatív transzlációs startjelző kodonok egyikét vagy másikát ismerik fel, így olyan bIGF-II prekurzorok keletkeznek, melyek alternatív (rövidebb) vezető szekvenciával rendelkeznek. Ha szükséges, ilyen rövidebb prekurzor peptideket más módon, például az alternatív ATG transzlációs kezdőpontjelző kodonok egyikével kezdődő, találmány szerinti szintetikus DNS molekulák felhasználásával is elő lehet állítani. Az itt izolált és szckvenláll génfragmensek vizsgálata az érett bIGF-II peptid egy másik prekurzora, az E domént (karboxil-terminális felőli túlnyúló részt) hordozó peptid felismeréséhez vezetett. E túlnyúló rész és az ezt kódoló DNS szekvenciája a következő: NH2-Arg-Asp-Val-Ser-Ala-Scr-Thr-Thr-Val-Leu 5’-AGG GATGTC TCT GCC TCT ACG ACC GTG CTT Pro-Asp-Asp-Val-Thr-Ala-Tyr-Pro-Val-Gly- CCG GAC GAC GTC ACC GCA TAC CCC GTG GGC Lys-Phe-Phe-Gln-Tyr-Asp-Ile-Trp-Lys-Gln- AAG TTC TTC CAA TAT GAC ATC TGG AAG CAG Ser-Thr-Gln-Arg-Leu-Arg-Arg-Gly-Lcu-Pro- TCC ACC CAG GGC CTG CGG AGG GGC CTG CCC Ala-Phe-Leu-Arg-Ala-Arg-Arg-Gly-Arg-Thr- GCC TTC CTG CGA GCA CGC CGG GGT CGC ACG Leu-Ala-Lys-Glu-Leu-Glu-Ala-Leu-Arg-Glu- CTC GCC AAG GAG CTG GAC GCG CTC AGA GAG Ala-Lys-Ser-His-His-Pro-Leu-Ile-COOH GCC AAG AGT CAC CAT CCG CTG ATC-3’ A bIGF-II DNS szekvenciájának felfedezése és izolálása nemcsak azért fontos, mert igazolta a tisztított bIGF-II esetén meghatározott aminosav-szekvenciát, hanem azért is, mivel lehetővé tette a bIGF-II vezető peptid és a karboxil-terminális felőli túlnyúló peptidrész (E dómén) DNS szekvenciájának és az ennek megfelelő aminosav-szekvenciák megismerését. Továbbá, a találmányunkban közölt új DNS-szekvenciák az ebben járatos szakemberek számára lehetővé teszik más bIGF-II prekurzor proteinek és/vagy ezek biológiailag aktív fragmenseinek azonosítását, elkülönítését és/vagy előállítását, ideértve - ám nem korlátozó jelleggel - más, bIGF-II-szerű aktivitást mutató peptideket is. Ezen peptidek fragmenseik vagy az ezeket tartalmazó egyéb termékek biológiai aktivitása magában foglalhatja, bár nem korlátozva csak ezekre a bIGF-II imént leírt növekedés- és/vagy lejelválasztást serkentő hatását, ez(eke)t az aktivitás(oka)t az itt leírt, vagy más in vitro és/vagy in vivo mérési módszerek alapján lehet meghatározni. A biológiailag aktív fragmenseket vagy termékeket az alábbiakban „IGF-II génnel kapcsolatos proteinek”-nck nevezzük, és olyan peptideket értünk e név alatt, mely peptideknek legalább egy részét a találmány szerinti DNS, vagy annak allélikus változata és/vagy a találmány szerinti DNS-sel hibridizáló DNS kódolja. Az IGF-II génnel kapcsolatos proteinek, akár a találmány szerinti DNS-t, akár annak variánsait felhasználva hozták is létre őket, a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az itt közölt DNS szekvenciák és gének lehetővé teszik az IGF-II bioszintézis és bioreguláció hatékonyabb tanulmányozását és/vagy kontrollálását. Továbbá, a találmányban leírt DNS szekvenciák felhasználhatók olyan más állatfajok IGF DNS-szekvenciáinak, IGF-génjeinek és IGF-génncl kapcsolatos peptidjeinck azonosítására és elkülönítésére, melyekben elegendő mértékű DNS-szekvencia- és/vagy peptid-homológia létezik, mint például (de nem kizárólag) a juh-, kecske- és sertésféléknél és madaraknál. A fentebb említett vezető (szignál) szekvenciák leírása lehetővé tette olyan, bIGF-II-szerű peptidek termelésére szolgáló vektor molekulák létrehozását, amelyek a szignál szekvenciákat felismerni és eltávolítani képes eukariota (például emlős- vagy élesztő)-sejtekben használhatók, illetve olyan, szignál szekvenciát és/vagy E domént tartalmazó bIGF-II prekurzor peptidek termelésére szolgáló vektormolekulák létrehozását, melyek prokariota (például baktérium) gazdában működnek. A találmányban leírt szintetikus peptideket rDNS technológiát alkalmazva, baktérium (például E. coli) vagy eukariota (például élesztő) gazdasejteket felhasználva a legcélszerűbb előállítani. Az itt leírt DNS-szekvenciákon módosításokat végrehajtva befolyásolhatjuk ezek hatékonyságát az adott gazdasejt peptidtermelésében. Ezek a módosítások kiteijedhetnek (bár nem kizárólag) a gazdasejt által gyakrabban használt kodonok helyettesítésére, a találmány szerinti pepiidet tartalmazó fúziós proteint kódoló DNS létrehozására, a transzlációt befolyásoló mRNS szerkezeti sajátságok megszüntetését vagy felerősítését célzó kodoncserékre vagy más olyan módosításokra, melyek fokozzák az ilyen peptidek termelését a választott gazdasejtben. Az ily módon előállított, a tisztított bIGF-II fentebb leírt biológiai aktivitásait lényeges mértékben kifejező peptideket a találmány szerinti peptidek ekvivalenseinek tekintjük. Az alábbi példák a találmány jellemző kivitelezési változatait illusztrálják. Ezek azonban semmiképpen sem korlátozzák a találmány oltalmi körét Az e tcrüle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
