202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
11 HU 202 582 B 12 ten járatos szakemberek számára különféle (egyéb) változatok nyilvánvalóak, akár kifejtjük azokat, akár nem. A hómérsékleti adatokat ’C-ban adjuk meg, ha csak külön nem jelezzük az eltérést 5 1. példa Ebben a példában árjuk le a bIGF-II teljes aminosav (AA) összetételének és szekvenciájának meghatározását abból a pepiidből, melyet a Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.) ivarérett szarvasmarhaszérum preparátu- 10 mából különítettünk el és tisztítottunk. A bIGF-II részlegesen tisztított frakcióit a Svoboda és munkatársai, valamint a Zumstein és munkatársai által leírt elkülönítési eljárásrác kombinációjával nyertük. A teljes tisztítást, amely az egyéb szarvasmarhapep- 15 üdéktől lényegében mentes blGF-ü-t eredményezte, fordított fázisú, nagyfelbontású folyadékkromatográfiával (MPLC) végeztük. Minden MPLC eljáráshoz trifluor-ecetsavat (TFA) és acetonitrilt használtunk. Az oldószert 2 ml/perc sebességgel adagoltuk az oszlopra Per- 20 kin-Elmer (Norwalk, Conn.) Series 4 MPLC szivattyúrendszert használva. A peptidet Newlett Packard (Greenly, Conn.) 1040AUV/VIS detektor segítségével tettük láthatóvá. Minden kromatográfiás eljárást szobahőmérsékleten (23-28 *C) végeztünk. 25 A kezded szekvencia-meghatározáshoz használt bIGF-II-t Chromega fluorodecyl 4,1 x 250 mm-es oszloppal (E. S. Industries, Marlton, N. J.) tisztítottuk. A bIGF-II-t a Chromega oszlopról 15-50% (tf%)-os lineáris acetonitril gradienssel eluáltuk több mint 35 30 percig, miközben a TFA koncentrációt 40 mM-on tartottuk. AbIGF-II teljes szerkezetének igazolásához használt bIGF-II mintákat Nucleosil C-18 4,1 x 250 mm-es oszlopon (Altech Associated, Deerfield, IL) állítottuk elő. 35 Az oszlopon való elválasztásra oldószerként 30-35% (tf%) lineáris acetonitril gradienst használtunk, több mint 15 percig, 20 mM-os állandó TFA koncentráció mellett. Az aktív bIGF-II azonosítását a patkány méhlepény radioreceptor vizsgálattal végeztük, ahogy Daug- 40 haday és munkatársai leírták. Ez a vizsgálat a kész mintákban lévő bIGF-II mennyiségének becslésére is alkalmas volt. A MPLC-vel üsztított bIGF-II aminosav-szekvencia analízisét az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) 45 Protein Sequencer Model 470A felhasználásával végeztük, a Nunkapiller és munkatársai (1983 a és b) által leírt módszereknek megfelelően. Röviden, 2,5 nM, MPLC- vel tisztított bIGF-II-t liofilizáltunk és a fenti Sequencer-en analizáltunk, olyan Edman-féle degradációs re- 50 akciót alkalmazva, amelyben az N-terminális aminosav adott reagenssel történő módosítását ezen aminosav hasítása, majd végül fenilüo-hidantoin (PTH) származékaként való felszabadítása követ. Mivel az N-terminális szekvencia-analízis nem volt *55 alkalmas a peptid teljes struktúrájának meghatározására, a üsztított IGF-II-t módosítottuk és enzimatikusan hidrolizáltuk a következő eljárást alkalmazva. A tisztítás után 75 mg blGF-ü-t perhangyasavval oxidálunk Hirs denaturációs módszerét felhasználva, amikor a denaluráció a szulfhidrilcsoportok ciszteinsav-maradékokká való átalakításán keresztül következik be. A peptidet 50 ml 88%-os hangyasavban (Fischer Scientific, Springfield, NJ) oldjuk fel, és az oldatot 0 ‘C-ra hűtjük. Egy órás szobahőmérsékleten történő inkubáció után 5 ml perhangyasav reagenst (0,5 ml 30% N202, Fischer Scientific) 9,5 ml 88%-os hangyasavban adunk a peptid-oldathoz. A keletkezett elegyet 10 *C-on tartjuk, miközben a reakció előrehaladását a másodikként leírt fordított fázisú MPLC módszerrel követjük. A reakció befejeződésekor (45 perc után) 4 ml vizet adunk az elegyhez, és a reagenseket csökkentett nyomású térben távolítjuk el. Speed Van Concentratort (Savant Instruments, Farmingdale, Ny) használva. Az oldószerek eltávolítása után fennmaradó anyagot 1 mM CaCl2-ot tartalmazó 1 M NaHC03-ban (mindkettő Fischer Scientific termék) oldjuk. Az enzimatikus hidrolízist 2 ml 8 mg/ml a-kimotripszint (Sigma Chemical Co.) tartalmazó 0,1 M MC1/2 mM CaCl2 oldat hozzáadásával (16 mg protein) indítjuk. 45 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a kimotripszint Centricon-10 (Amicon Corp., Danvers, MA) ultrafiltrációs készülék segítségével távolítjuk el. A szűrletet (0-IGF-II kimotripszines hidrolizátumot) fordított fázisú kromatográfiával vizsgáljuk, az előzőleg leírt Nucleosil oszlopot és 20 mM TFA /acetonitril oldószert használva. Több mint 30 percig 10-től 70% (tf%)os lineáris acetonitril gradienssel eluálva az oszlopot, a hidrolizátumban 10 nagyobb peptid-tartalmú csúcs látszik. Három elkülönített csúcs peptidjeinek szekvenciaanalízise (Model 470A Sequencer-rel kapcsolt Applied Biosystems Inc. Model 120APTM Analyzer segítségével végezve, mint azt korábban leírtuk) szerint két csúcs peptidjei tartalmazzák azokat az aminosavakat, melyek a bIGF-II elsődleges szerkezete megfejtésének befejezéséhez még szükségesek. AII. táblázat a MPLC csúcs szerinti anyag N-terminális szekvencia-analízisét mutatja, az emberi és a patkány IGF-II-k korábban már közölt szekvenciáival együtt. A bIGF-II 1-43. aminosav-maradékait a tisztított bIGF-II N-terminális szekvencia-analízisével határoztuk meg. A 37-59. és a 60-67. aminosav-maradékokat a két különböző kimotripszines fragmens N-terminális szekvencia-analízisével határozzuk meg. A peptidek moláris ciszteinsav-tartalmát Larsen és munkatársai leírása alapján, előoszlopos ortoftál-aldehid aminosavanalízissel igazoljuk. A szarvasmarha és az emberi szekvenciák, valamint a szarvasmarha és a patkány szekvenciák között egyaránt 3-3 eltérést találtunk, amint azt a U. táblázat mutatja II. Táblázat IGF-II aminosav-szekvenciák 5 10 15 Szarvasmarha NH2-Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Gln-Phe-Ember NH2-Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Gln-Phe-Patkány NH2-Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Gln-Phe-7
