202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
7 HU 202 582 B 8 szelekben (a vizsgálat részletesen ismerteti Gospodarowicz és munkatársai 5. sz. irodalom). A patkány L6 mioblaszt sejtosztódások számának a találmány szerinti peptidek okozta in vitro növekedése jelzi hatékonyságukat a mioblaszt sejtosztódások számának, majd ennek következtében in utero az izomrostok végsó tömegének fokozásában. A patkány L6 mioblaszt sejtek sejtosztódásszámának növekedése továbbá arra is utal, hogy a találmány szerinti peptideket ivarérett állatok izomhipertrófiájának növelésére is fel lehet használni, elsősorban a szatellit izomsejtek sejtosztódásának serkentése útján. Atejtermelés céljából tartottállatoknál a tejprodukció limitáló faktora éppen az emlő epitéliális szövetének mennyisége, mivel e szövet sejtjei termelik és választják ki a tejek In vitro kísérleti rendszerek segítségével kimutatható volt, hogy az állatok emlőmirigyeiből nyert epitéliális sejteket a bIGF-II sejtosztódásra és a tej alkotóelemeinek nagyobb mennyiségben való termelése serkentette. Egy ilyen in vitro kísérleti rendszerben kimutatták azt is, hogy az osztódásra késztetett emlő epitéliális sejteket vissza lehet ültetni a megtisztított emlő zsírpárnákba (lásd: Yang és Nandi munkáját), ahol is ezeket osztódásra és/vagy tejtermelésre lehet késztetni. Ezek a felfedezések azt mutatják, hogy a találmány szerinti peptidek in vivo biológiailag hatékonyak a szarvasmarha tejtermelésének fokozásában, vemhes tehenek illetve üszők esetén, megfelelően alkalmazva. Egy ilyen technikát közöl az elbírálás alatt lévő, 1986. március 7-én benyújtott 837 477 számú amerikai bejelentés, melynek megállapításaira itt utalunk. A jelen találmány szerinti peptidek felhasználhatók állatok, elsősorban (de nem kizárólagosan) nem ember kezelésére a tejtermelés fokozására és/vagy a hús/zsfir arány, vagy pedig az izomtömeg növelése érdekében. Ilyen felhasználás esetén a találmány szerinti egy vagy több peptidet (vagy azok nem-toxikus sóit) nem-toxikus, fiziológiailag elfogadható (folyadék vagy szilárd) hordozóval kombinálva juthatunk olyan készítményhez, melyet bármely megfelelő módon, így például intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intranazálisan vagy - az emésztőszervek peptidbontó működésétől védő alakban - szájon át adagolhatunk az állatoknak. Ilyen készítményeket injekció, infúzió vagy implan, táció útján adhatunk az állatnak, leginkább olyan közegben (például olajos diszperzió vagy polimer), amely elősegíti, hogy az állat célsejtjei a kívánatos sebességgel vehessék fel a peptidek Az ilyen készítményekben a hordozó és a biológiailag aktív peptid aránya bármely olyan érték lehet, amely elősegíti az állatban a kívánt hatás elérését. A legkedvezőbb arányokat az ezen területen járatos szakember könnyen meghatározhatja. A szükséges dózis az adott helyzetben várt eredménytől és a kívánt kezelés idejétől függ. A kívánt eredmény (például megnövekedett tejprodukció) elérése szempontjából leghatékonyabb dózis vagy mennyiség rutinkísérletekben határozható meg. Az alkalmazandó dózis olyan változóktól függhet, mint az adott állat mérete, általános egészségi és táplálkozásbeli állapota. A találmány szerinti, biológiailag aktív peptideket lényegében tiszta, azaz a találmány szerinti peptidek bioaktivitását befolyásoló egyéb (bármilyen eredetű) peptidektől mentes formában lehet felhasználni. Ez azonban nem szükségszerű, mivel a találmány szerinti peptidekkel, például más olyan állati növekedési faktorokkal, mint a szarvasmarha (vagy más állati) IGF-I, EGF epidermális növekedési faktor, vagy TGF-a (alfatranszformáló növekedési faktor) keverten vagy más módon kombinálva is kielégítően (sőt sok esetben előnyösen) lehet alkalmazni számos célra. A szintetikus DNS megnevezés, ahogy azt a továbbiakban használjuk, olyan DNS-t jelöl, amelyet az élő állatban végbemenő természetes replikációjától eltérő módon állítottak elő. A leírásban leírt nukleotid-szekvenciák felhasználásával a találmány szerinti bármely DNS-t elő lehet állítani a szakirodalomból jól ismert különféle technikákat, például automata DNS szintetizáló készüléket, egyéb kémiai szintézis-módszereket, cDNS-t vagy valamely mikroorganizmusban történő klónozást alkalmazva. Bármely megfelelő technika felhasználható. Az „(adott) nukleotid-szekvenciát tartalmazó” kifejezést a továbbiakban annak megjelölésére használjuk, hogy az illető DNS-ben az adott nukleotidok sorát nem szakítják meg át nem íródó nukleotidok (pl. intronok). Mivel a természetben megtalálható bIGF-II DNS ilyen nem transzlálódó nukleotidokat tartalmaz, a találmányban leírt DNS, amely ilyen, nem transzlálódó nukleotidokat nem tartalmaz, ipso facto „szintetikus”. Nukleinsav (DNS vagy RNS) szekvenciákat vagy molekulákat „alapvetően tisztának” nevezünk, ha ezek alapvetően mentesek az olyan nukleinsav-szekvenciáktól, melyekkel természetes állapotukban együtt fordulnak elő. A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint érett bIGF-II peptidet, egy 24 aminosavas vezető (leader) szekvenciát tartalmazó prekurzort és a karboxil-terminális vég felőli 89 aminosavas túlnyúló rész (E dómén) 68 aminosavát kódoló DNS fragmenseket izolálunk és szekvenálunk. Amint azt a 4. példában lenjük, olyan alapvetően tiszta DNS fragmenseket izolálunk szarvasmarhavese genomiális DNS-ből, melyek a fenti peptideket kódolják. Ezen fragmensek analízise alapján a blGFII prekurzor protein DNS-szekvenciája a következő: NH2-Met-Gly-Ile-Pro-Met-Gly-Lys-Ser-Met-Leu-5’-ATG GGA ATC CCA ATG GGG AAG TCG ATG CTG Val-Leu-Leu-Thr-Phe-Leu-Ala-Phe-Ala-Ser- GTG CTT CTC ACC TTC CTT GCC TTC GCC TCG Cys-Cys-Ile-Ala-Ala-Tyr-Arg-Pro-Ser-Glu- TGC TGC ATT GCT GCT TAC CGC CCC AGC OAO Thr-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr- ACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG G AC ACC Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe- CTC CAG ITT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Ser-Ser-Arg-Ile-Asn- TAC ITC AGC CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys- CGACGC AGC CGTGGC ATC GTG GAAGAG TGT 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
