202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
23 HU 202 582 B 24 és M13mpl9 (New England Biolabs) szekvenáló vektorokba. A JM101 sejtekbe történt transzformáció [Maniatis, (250. oldal), valamint Messing és munkatársai] után kapott tarfoltokat az IGF-IIA vagy az IGF-IIB oligomerekkel hibridizálva vizsgáljuk a kívánt, exon szekvenciákat tartalmazó kiónok azonosítása érdekében. E hibridizációkhoz a szintetikus oligomereket végjelöljük Maniatis leírása szerint (122. oldal). Az előhibridizációs puffcroldatot úgy változtatjuk meg, hogy kihagyhassuk a formamidot, míg az SSPE és a Denhardtoldat koncentrációját 6x-osra illetve 10x-esre növeljük, amint azt Meinkolh és munkatársai leírják. A hibridizációt 30-37 *C-on végezzük, és a mosás hőmérsékletét 37 ‘C-ra csökkentjük. A szűrőket rövidebb ideig (5-10 perc) mossuk 6 x SSPE/0,1 % SDS-ben. Azokból a plakkokból, melyek bármely próbával hibridizáltak, DNS-t izolálunk, ahogy azt Messing és munkatársai leírják. A tisztított és egyszálú DNS-t a didcoxi-technikát alkalmazva szekvenáljuk, ahogy azt Sanger és munkatársai leírják, de az eredeti leírásban szereplő P-32 nuklcotidok helyett kén-35-tel jelölt nukleolidokat (Amersham Corp., Arlington Heights., IL) használunk. Az exon/intron kapcsolódási helyeket a következő három követelmény alapján azonosítottuk: Nyílt leolvasási keretek (open reading frames), exon/intron kapcsolódási szekvenciák, illetve az emberi cDNS szekvenciákkal való analógia. A következő szekvenciákban az azonosított exon/intron kapcsolódási helyeket a kapcsolódási hely két oldalán lévő két (szomszédos) nukleotid aláhúzásával jelöljük. A fenti szekvenálás alapján, az érett bIGF-II peptidet kódoló nukleotid szekvencia a következő: 5’-GCT TAC CGC CCC AGC GAG ACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC TAC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC CGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT TGC TTC GG A AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC GAG-3’. A fentebb leírt eljárással határoztuk meg a következő DNS szekvenciát, amely egy, 24 további aminosavból álló vezető részhez közvetlenül, amino-végével kapcsolt bIGF-II-t kódol: 5’-ATG GGA ATC CCA ATG GGG AAG TCG ATG CTG GTG CTT CTC ACC TTC CTT GCC TTC GCC TCG TGC TGC ATT GCT GCT TAC CGC CCC AGC GAG ACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC TAC TTC AGG CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC CGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT TGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC GAG-3’. Szintén a fenti eljárással határoztuk meg azt a következő DNS-szekvenciát, amely egy 68 aminosavból álló, karboxil-vég felőli meghosszabbított részhez közvetlenül kapcsoltan kódolja a bIGF-II-t: 5’-GCT TAC CGC CCC AGC GAG ACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC TAC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC CGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT TGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC GAG AGG GAT GTG TCT GCC TCT ACG ACC GTG CTT CCG GAC GAC GTC ACC GCA TAC CCC GTG GGC AAG TTC TTC CAA TAT GAC ATC TGG AAG CAG TCC ACC CAG CGC CTG CGC AGG GGC CTG CCC GCC TTC CTG CGA GCA CGC CGG GGT CGC ACG CTC GCC AAG GAG CTG GAG GCG CTC AGA GAG GCC AAG AGT CAC CAT CCG CTG ATC-3’. A fenti módszerrel meghatároztuk az előbb említett N-tcrminális vezető és C-tcrminális meghosszabbított részt tartalmazó bIGF-II prekurzort kódoló DNS-szekvenciát. Ez a következő: 5’-ATG GGA ATC CCA ATG GGG AAG TCG ATG CTG GTG CTT CTC ACC TTC CTT GCC TTC GCC TCG TGC TGC ATT GCT GCT TAC CGC CCC AGC GAG ACT CTG TGC GGC GGG GAG CTG GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC TAC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CGC ATA AAC CGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT TGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
