202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
15 HU 202 581 B 16 mert (I) (kb. 100 mg) a megfelelő 3’-foszfodiészteiré (II) alakítunk, 1: 9 térfytérf. terc.butilamin : piridin oldatban való kezeléssel. A 3’-foszfodiésztert (ü) egy 5’-szabad nukleozid gyantával (III) kondenzáltatjuk, kondenzálószeiként mezitilén-szulfonil-nitro-triazolidet (MSNT, 100 mg) alkalmazva. A kezeletlen gyanta (III) 5’-hidroxilcsoportját accülezzük, 1 : 9 térfytérf. ecetsavanhidrid : piridin oldat alkalmazásával. Az ezt követő kezelés, 2% triklórecetsavat (TCA) tartalmazó metilénkloridban, a (IV) detritilezett termeket szolgáltatja. Az előbbi reakciósorozatot addig ismételjük, amíg a kívánt specifikus szekvenciát meg nem kapjuk. Az így előállított, kötött oligomert tartalmazó gyantához (kb. 20 mg) 0,5 ml 0,5 M tetramedl-guanidin-piridin-2-aldoximot tartalmazó 15 :4 térf./térf. arányú piridines-vizes oldatot adunk. 8 órán át 37 ‘C-on való reagál tatás után a reakcióelegyet 55 ‘C-on 8 órán át tömény vizes ammóniával kezeljük. Az oldatot gélszűrésnek vetjük alá, kisméretű (2,5 x 60 cm), Sephadcx G-50 töltetet (a Pharmacia cég által előállított cellulózgyanta) tartalmazó oszlop alkalmazásával. így egy DMTr oligomert kapunk. Ezt az oligomert tovább tisztítjuk, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLQ módszerrel, fordított fázisú oszlopot (SSC-ODS-272,0,6 x 20 cm) és A oldatként 0,02 M trietil-ammónium-acetátot - pH 7,0 - és B oldatként 0,02 M TEAA-val elkészített 50%-os acetonitrilt - pH 7,0 - alkalmazva. Az oldatokkal lineáris koncentráció-gradienst alakítunk ki. Az ily módon tisztított DMTr oligomert szobahőmérsékéleten 80%-os ecetsavval kezeljük, 20 percen át így detritilezést hajtunk végre, amelyet az előbbi HPLC követ Az eluátumot 10 mM trisz-HCl (pH 7,5) -1 mM EdEDTA (ph 8,0) eleggyel szemben dializálva a keresett oligomert kapjuk. Az így előállított, teljesen védőcsoportmentes oíigo-dezoxiribonukleotid homogenitását annak a ténynek a segítségével igazoljuk, hogy a fordított fázisú oszlopkromatográfia csak egyetlen csúcsot eredményezett és a 15%-os poliakrilamid gél-7 M karbamid közegben végzett elektroforézis - amelyet megelőzően az 5’-véget jelzetté tettük, (gamma-32P)-ATP-t és T4 polinukleotidkinázt alkalmazva - csak egyetlen egyszeres sávot mutat ív) Az alfa-IFN gén beépítése - A pBM 034 plazmid előállítása A pBM 030 plazmidot a 6. ábrán bemutatott módon a p9B312 plazmádból állítjuk elő. Ez a plazmid tartalmazza az eredetileg a BmNPV-ban előforduló promoter és terminátor tartományt, 3 bázispár (3 bp) kivételével, és ezek között a tartományok között egy többszörös kötőtag van jelen a poliéderes gén helyett amint ezt a 7. ábrán bemutatjuk. A 6. ábrán bemutatott módszer - p9M312 előállítása p9B312-ből - in vitro mutagenezis (oligonukleotidra irányuló mutagenezis: Nucleic Acids Research 9 (15), p. 3647-3656,1981) néven ismert. Ezt a módszert más esetekben is alkalmaztuk. A pBMo30 vektorba az alfa-IFN gént a 9. ábrán bemutatott eljárással visszük be, a pBMo34 előállítására. F. A Bm sejtek transzfekciója - a rekombináns BmNPV előállítása A BmNPV T3 törzs vírus-DNS-ét (ATCC 40188) és a pIFN-l-B241-t 1:100 arányban a következő összetételű I és II oldattal keverjük össze: I: desztillált víz 2,1 ml hodrozó DNS (lazachere, 1 mg/ml) 50 pl BmNPV 10 pl pIFN-l-B241 DNS 50 pg 2 M kalciumklorid 300 pg II: 50 mM HEPES puffer (pH 7,1), amely NaCl-ra 0,28 M 2,5 ml foszfát-puffer (35 mM Na2HP04- -35 mM NaH2P04 50 pl A kapott szuszpenzióból 1 ml-es adagot hozzáadunk 4 ml Bm sejttenyésztő táptalajhoz annak érdekében, hogy az előbbi DNS-t ily módon bevigyük a Bombyx móri sejtekbe. 20 óra elteltével a táptalajt friss adaggal helyettesítjük. 5 napon át való további tenyésztés után a közeget centrifugáljuk. A tiszta felülúszót az alfa-IFN aktivitás meghatározására irányuló vizsgálatnak vetjük alá. A felülúszót - amelyet úgy nyerünk ki, hogy a közeget 1000 ford/perc sebességgel 5 percen át centrifugáljuk - ezután hígítjuk és plakk meghatározásnak vetjük alá. 4 nap után mikroszkóp alatt megvizsgáljuk a plakkokat és szelektáljuk a poliédermentes plakkokat. Ezt az eljárást háromszor megismételve egyetlen vírus törzset kapunk, amely a rekombináns BmNPV-vel azonos. Ezzel a vírus törzzsel Bm sejteket fertőzünk és 5 napi tenyésztés után a közeget elkülönítjük. G. Az alfa-IFN kifejeződése Bombyx móriban Az 5. lárvaállapot 1. napján perkulán injekcióval selyemhernyókba bevisszük azt a közeget, amelyet az F. pont szerint 5 napi tenyésztés után különítettünk el, vagy azt a közeget, amelyhez oly módon jutottunk, hogy az egyedüli vírus törzzsel 0,5 ml/egyed (107 pfu) dózissal fertőzést hajtottunk végre és ezt követően 5 napon át tenyésztést végeztünk. A selyemhernyókat ezután szederlevéllel tápláljuk, 5 napon át, 25 *C-on. Ezt követően összeszívó tűt szúrunk a hasi nyúlványba és a testfolyadékot jéggel hűtött Eppendorf csőben fogjuk fel. Azonos térfogatú TC-10 táptalaj hozzáadása után a testfolyadékot centrifugáljuk (10 Ö00 ford/perc, 5 perc) és meghatározzuk a felülúszó alfa-IFN aktivitását. H. Az alfa-IFN biológiai meghatározása i) Aktivitásmérés Az alfa-IFN aktivitás meghatározását C. Philip et al. módszere szerint (Methods in Enzymology 78, p. 387- 394,1981) úgy végezzük, mint a citopátiás hatás (CPE, lásd a fenti cikket) gátlásának (az 50%-os citopátiás hatás gátlásnak) a meghatározását, 96 helyes mikrotitráló lemezen, humán amnionból vett FL sejtek és hólyagos ínygyulladás vírus (VSV) alkalmazásával. Az öszszehasonlításhoz az Egyesült Államok Országos Egészségügyi Intézetéből (NIH) származó alfa-IFN standardot alkalmazunk. A kapott eredményeket (az egyes vírus törzsekre vonatkozóan külön-külön) az alábbi 1. és 2. táblázatban mutatjuk be. 1. táblázat Plazmid NE/ml Tenyésztett BM sejtfolyadékban pIFN-l-B-241 1,2x10* pIFN-2-B-241 1,3x10* pIFN-2-B-587 24 pIFN-2-B-310 1,5x10* 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
