202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
17 HU 202 581 B 18 Plazmid NE/ml pIFN-2-B-276 1,4x10* pIFN-2-B-585 4,8x10* A selyemhernyó testfolyadékában pIFN-l-B-241 3,0x10* 2. táblázat Plazmid NE/ml A selyemhernyó testfolyadékában pIFN-2-B-241 6,6x10® pIFN-2-B-587 3,5xl02 pIFN-2-B-310 4,4xl07 pIFN-2-B-276 3,6xl07 pIFN-2-B-585 4,2x107 pBM034 1,0x10® ii) Az alfa-IFN N-terminálisának meghatározása Antitcstoszlopon való tisztítás után meghatározzuk a selyemhernyóban, pB034 alkalmazásával előállított alfa-IFN N-terminálisát. A terminálisban talált 11 aminosav megfelel a standard alfa-IFN-N-terminális összetételének. Ez azt jelenti, hogy a selyemhcmyósejt helyesen ismeri fel a humán fehérje szignál szekvenciáját és a kifejeződés a sejtben pontos feldolgozás mellett megy végbe. J. A beta-IFN gént tartalmazó rekombináns BmNPV előállítása és kifejeződése in vitro és in vivo A humán genom 4A fág-vektor rekombináns készletét megvizsgáljuk beta-IFN gén jelenlétére. Az így kapott, a beta-IFN gént tartalmazó DNS-t HindlI-vel elbontjuk és a beta-IFN gént tartalmazó fragmentumot agaióz gélelcktroforézissel elkülönítjük. Ezt a fragmentumot hozzákapcsoljuk a pUC9 Hindii helyéhez. A kapott plazmidot HindlI-vel és BglII-mal kezeljük. A beta-IFN gént tartalmazó fragmentumot az előbbi E. fejezetben leírt módszerrel elkülönítjük és EcoRV-vel kezelt pBM010-val kapcsoljuk össze. Ezt a plazmidot pBM211 jelöléssel látjuk el. A rekombináns vírust az előbbi F. fejezetben leírt módon különítjük cl. Az így előállított rekombináns BmNPV-t használva a selyemhernyóban való expressziót az előbbi G. fejezetben leírt módszerrel folytatjuk le. Amikor a beta-IFN aktivitását határozzuk meg - a H. fejezet szerinti módszerrel, standard beta-IFN minta alkalmazásával azt találjuk, hogy a rekombináns BmNPV kb. 8 x 105 egység/ml bcta-IFN-t termel a vérnyirok rendszerben és 8 x 10* egység/ml beta-IFN-t a Bm sejtben. A rekombináns vírus által termelt IFN-t a humán bcta-IFN-nek megfelelő monoklonális antitesttel semlegesítjük. Bár a találmányt konkrét foganatosítási módokkal kapcsolatban, ezekre hivatkozva írtuk le részletesen, a szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szellemétől és terjedelmétől való eltávolodás nélkül abban különböző változtatások és módosítások hajthatók végre. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás fehéijék előállítására, vírusvektorok alkalmazásával az élő organizmus szintjén, azzal jellemezve, hogy i) a Bombyx móri nukleáris polihcdrózis vírus (BmNPV) DNS-éből restrikciós enzimmel kimetsszük a) a poliéderes fehérje termelését kódoló strukturális gént, egy, az említett strukturális génhez képest felszálló irányban elhelyezkedő 5’-felszálló szakasszal együtt, amely magában foglalja az említett strukturális gén promoter tartományát is, és b) az említett strukturális génhez képest leszálló irányban elhelyezkedő 3’-leszálló tartományt, ii) a kapott DNS fragmentum strukturális gén tartományát egy fehérjét kódoló génnel helyettesítjük, iii) a helyettesítési terméket beépítjük egy plazmidba, iv) az így előállított plazmidot, amelyet az átvitel céljából a BmNPV DNS-sel kombinálunk, transzfekció végrehajtására Bombyx móri sejtekbe vagy Bombyx móri gazdaszervezetbe visszük be és a rekombináns BmNPV DNS-t klónozzuk, és v) az így kapott, rekombináns BmNPV DNS-t tartalmazó Bombyx móri sejteket vagy gazdaszervezetet szaporítjuk, és a kifejezett proteint elválasztjuk. 2. Eljárás fehérjék előállítására, vírusvektorok alkalmazásával az élő organizmus szintjén, azzal jellemezve, hogy a) a poliéderes fehérje termelését kódoló strukturális génhez képest felszálló irányban elhelyezkedő 5’fclszálló BmNPV DNS szakaszt, b) a fehérjét kódoló struktúrgént és c) a poliéderes fehérje termelését kódoló strukturális génhez képest leszálló irányban elhelyezkedő 3’leszálió tartományt tartalmazó rekombináns BmNPV DNS-t Bombyx móri sejtekben vagy Bombyx móri gazdaszervezetben kifejezünk, és a proteint elválasztjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 10
