202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
13 HU 202 581 B 14 hiányzik az ATG-hez felszálló irányban a 82. bázispár, a 19. bázispár, a 18. bázispár és a 7. bázispár és az ATG. Azt, amelyből az ATG-hez képest leszálló irányban hiányzik a23. bázispár, p9B312 jelöléssel látjuk el. A szóban forgó tartomány bázis szekvenciáját a 4. ábrán mulatjuk be. D. Olyan plazmidok előállítása, amelyekből hiányzik a polihederon strukturális génszakasz A p9B241 plazmidot EcoRI-vel és AatlI-vel (a Toyobo Co., Ltd. terméke) kezeljük. Az előbbi C-l lépés szerint előállított p8H225 plazmidot ettől függetlenül EcoRI-vel, AatlI-vel és Scal-vel (a New England Biolabs, Amerikai Egyesült Államok terméke) kezeljük; (így egy, a pUC8-ból származó szükségtelen fragmentumot Scal-vel egy kis darabbá alakítunk át). A két reakcióelegyet külön-külön fenollal, majd kloroformmal kezeljük és etanollal kicsapjuk. A kél kicsapódott DNS-t ligációs reakcióba visszük és a kapott plazmidokkal E. coli K12 JM83-at transzformálunk. A transzformánsokból extraháljuk a plazmidokal és kiválasztunk egy olyan plazmidot, amelyben a felszálló és leszálló irányú vírus DNS-ek egyaránt megfelelő irányúak. Különböző restrikciós enzimekkel végzett hasítás arra mutat, hogy ez a rekombináns plazmid ampicillin rezisztencia maikerrel rendelkezik és a következőket tartalmazza;- a vírus DNS egy felszálló szakasza, amely a polihedron gén ATG start kodonjától felszálló irányban számítva a 30. bázispárral kezdődik és terjedelme kb. 3 kb az említett 30. bázispárhoz képest felszálló irányban (ez a szakasz magában foglalja a promoter tartományt) és- egy kb. 3,1 kb terjedelmű szakaszt, ennek a génnek a terminációs kodonjához képest leszálló irányban (ebből azonban hiányzik kb. 300 bázispár a terminációs kodonhoz képest leszálló irányban), mimellelt mindegyik iránya megegyezik az eredeti vírusban találhatóéval. Ez a plazmid E. coli rendszerekben szaporítható, neve p89B241. Hasonló módon állítjuk elő a p89B587, p89B310, p89B276 és p89B585 plazmidot, a p9B587, p9B310, p9B276 és p9B585 plazmid alkalmazásával. E. Az alfa-IFN gén beültetése. A pIFN-l-B241 plazmid felépítése i) A lcukocita IFN gént egy humán lambda fágokat (Charon 4A rekombináns) tartalmazó készletből [Lawn et al., Cell 15, p. 1157-1174 (1978)] választjuk ki. Az így kapott DNS-t, amely az alfa-IFN-J gént tartalmazza, HindlII-vel és EcoRI-vel kezeljük, agaróz gél elektroforézissel elkülönítünk egy alfa-IFN-J gént tartalmazó fragmentumot és ezt HindlII-vel és EcoRI-vel kezelt pUC9-cel visszük ligációs reakcióba. A kapott plazmiddal E. coli K12 JM83-at transzformálunk. A transzformánsból kinyerjük a plazmidot, ezt MslII- vel (a New England Biolabs, Amerikai Egyesült Államok terméke) és PvuII-vel (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke) kezeljük, elkülönítünk egy alfa-IFN-J gént tartalmazó DNS fragmentumot és ennek mindkét végéhez egy Smal linkért (a Takara Shuzo Co., Ltd terméke) csatlakoztatunk. A kapcsolási terméket Smal-vel kezeljük és egy, a D. lépés szerint kapott p89B241 plazmidból származó Smal fragmentummal visszük ligációs reakcióba, rekombináns plazmid keletkezése mellett. Miután meggyőződtünk arról, hogy az alfa-IFN-J gén a helyes irányban beépült ebbe a plazmidba, a plazmiddal E. coli K12 JM83-at transzformálunk és a transzformált törzset tenyésztjük. így nagymennyiségű plazmidot állítunk elő, amelyet pIFN-1-B241 -nek nevezünk. Ebben a plazmidban egy, a polihedron génhez képest felszálló irányban (kb. a -3 kb bázispártól a -30 bázispárig) elhelyezkedő szakaszt a p89B241 plazmid létrehozására használt linkemek egy 13 bp terjedelmű maradéka követi, majd a kromoszómából származó alfa-IFN-J gén egy 32 bp terjedelmű 5’-nem-transzlációs tartománya, ezt a tartományt viszont az ATG-vei kezdődő és helyes irányú alfa-IFN-J gén követi. Jelen van továbbá egy, a polihedron génhez képest leszálló irányú szakasz (a terminációs kodontól számítva leszálló irányban kb. 300 bp-nél elhelyezkedő bázispártól kezdve egy, ettől a bázispártól számítva leszálló irányban kb. 3,1 kbp-nál elhelyezkedő bázispárig), az alfa-IFN génhez kapcsolódva. ii) Az alfa-INF gén beépítése. A pIFN-2B plazmidok létrehozása E. coli K12 JM83-at transzformálunk az előbbi plazmiddal, vagyis azzal a ligációs termékkel, amelyet az előbbiekben említett alfa-IFN-J gént tartalmazó HindlII-HindlII fragmentumból és pUC9-ből állítottunk elő. A plazmidot a transzformánsból kinyerjük, Hpall-vel (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke) kezeljük, elkülönítünk egy alfa-IFN-J gént tartalmazó DNS fragmentumot és ezt ligáljuk egy kémiai úton szintetizált oligomer (CGGGCCATC) - amelyet 32P-ATP és T4 polinukleotid kináz (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke) felhasználásával foszforiláltunk - és egy másik szintetikus oligomer (CCGGGATGGCC) hibridizációs termékével. A ligációs terméket agaróz gél elektroforézissel elkülönítjük, majd extraháljuk, ismét foszforiláljuk 32P-ATP és T4 polinukleotid kináz alkalmazásával és ligáljuk az előbbi D lépésben kapott p89B241 plazmid Xmal-fragmentumával (az enzim a New England Biolabs, Amerikai Egyesült Államok terméke), ilyen módon rekombináns plazmid keletkezik. Annak a ténynek a megerősítése után, hogy az alfa-IFN-J gén a helyes irányban épült be ebbe a plazmidba, E. coli K12 JM83-1 a plazmiddal transzformálunk és tenyésztjük a transzformánst. Ennek során nagy mennyiségben keletkezik a plazmid. Ezt a plazmidot pIFN-2-B-241-nek neveztük el. Ebben a plazmidban egy (a polihedron géntől számított) felszálló szakaszt (egy kb. 3 kb bázispártól felszálló irányban -30 bázispárig) a p89B241 plazmid előállításához használt linker 13 bp maradéka követ, majd az alfa-IFN-J gén következik, ATG-vel kezdve és a helyes irányba beilleszkedve, és ezután egy leszálló (a polihedron génhez képest) szakasz Figyelhető meg (a terminációs kodonhoz képest leszálló irányban egy kb. 300 bp bázispártól egy kb. 3,1 kb bázispárig, az előbbi bázispárhoz képest leszálló irányban). A pIFN-2-B587, pIFN-2-B310, pIFN-2-B276 és plFN-2-B585 plazmidot hasonló módon állíthatjuk elő, kiindulási anyagként a p89B587, p89B310, p89B276 és p89B585 plazmidot alkalmazva. iii) Az összekötő (linker) tag szintézise Az oligo-dczoxiribonuklcotidek kémiai szintézise: A H. Ito et al. (Nucleic Acid Research 10, p. 1755, 1982) által leírt eljárás szerint, és amint ezt az 5. ábrán vázlatosan bemutatjuk, oligomereket szintetizálunk a szilárdfázisú módszer segítségével, polisztirol gyantát alkalmazva. így egy teljesen védett bifunkcionális di-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
