202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
11 HU 202 581 B 12 gatú fenol oldatot - amely 10 mM trisz-HCl (pH 7,6) puffenel és 1 mM EDTA-val készül, telített oldatként - adunk, a keveréket kb. 5 percen át enyhén rázatjuk, majd 5 percen át 12 000 ford/perc mellett centrifugáljuk. A vizes réteget elkülönítjük és a fenolos kezelést azonos módon még kétszer megismételjük. Ehhez a DNS-t tartalmazó vizes réteghez hozzáadunk azonos térfogatú kloroformot, majd kb. 5 percen át enyhén rázzuk és 2 percen át 12 000 ford/perc mellett centrifugáljuk. A vizes réteget elkülönítjük, ugyanezt a kloroformos kezelést kétszer megismételjük, és a vizes réteget kb. 2 napon át 10 mM trisz-HCI puffer (pH 7,6) - 1 mM EDTA oldattal szemben dializáljuk. Az így kapott vírus DNS-t (ATCC 40188) használjuk fel a következő gén-klónozási lépésben és a Bm sejtek transzfekciójára. B-2 A polihedron gén klónozása Próbakészítmény: az 5. lárvaállapotban lévő selyemhernyókat perkután fertőzünk a BmNPV T3 törzzsel. Néhány nap elteltével a teljes mennyiségű RNS-t elkülönítjük a test zsírszöveteiből - a guanidin-hidroklorid módszer segítségével - és oligo(dT)ccllulóz oszlop alkalmazásával tisztítjuk. így egy poli(A)-t tartalmazó mRNS-t kapunk. Ezt az mRNS-t az in vitro nyúl retikulocita transzlációs rendszer (H. Weissbach, S. Ochoa, Ann. Rev. Biochem. 45, p. 191, 1976) alkalmazásával vizsgáljuk és azt találjuk, hogy a teljes mRNS mennyiségének 90%-át vagy még nagyobb hányadát a polihedront kódoló mRNS teszi ki. Az mRNS mint templát és az oligo(dT) mint primer alkalmazásával, reverz transzkriptázzal (a Mól. Clon. p. 211-246 helyén leírt módon) cDNS-t szintetizálunk. Ez alkalommal szubsztrátként 32F-t tartalmazó dCTP-t használunk és az így jelzett cDNS-t használjuk fel mintaként a polihedron gén jelenlétére vonatkozó szűrés során. A polihedron gént tartalmazó EcoRI fragmentum klónozása: A BmNPV T3 tisztított DNS-ét EcoRI-vel elbontjuk. A fragmentumokat 0,7% agarózt tartalmazó gélben elektroforézisnek vetjük alá, és átvisszük egy nitrocellulóz szűrőre, majd az előbbiekben leírt mintával hibridizáljuk. Egy konkrétan hibridizált, kb. 10,6 kb nagyságú DNS fragmentumot beépítünk a pBR-322 plazmidba, annak EcoRI hasítási helyén. A vírus DNS-t EcoRI-vel elbontjuk, majd elvégezzük ugyanazt a fenolos kezelést és kloroformos kezelést, amelyet az előbbi B-l lépésben leírtunk. A vizes réteget elkülönítjük, hozzáadunk 1/20 térfogatnyi 4M nátriumklorid oldatot és 2 térfogatnyi hideg etanolt és a kicsapódott DNS-t kis térfogatú trisz-pufferben (10 mM trisz-HQ - pH 7,6 - és 1 mM EDTA). A pBR-322-t külön elbontjuk EcoRI- vel, majd ugyanígy kezeljük, ezután B AP-pal (bakteriális lúgos foszfatáz, Bclhesda Research Laboratories) végzett kezelésnek vetjük alá. Ezt követően az előbbiek szerint ismét fenolos kezelést és kloroformos kezelést végzünk, majd etanol hozzáadásával kicsapást hajtunk végre. A csapadékot kis térfogatú trisz-pufferben oldjuk. A vírus DNS és a pBR 322 EcoRI-vel kapott bomlástermékeit 5 *C-on 10 órán át T4 ligáz hozzáadása mellett ligációs reakcióba visszük. A ligáció termékét beviszsziik a kereskedelemben kapható E. coli KI2 JM83-ba és a termékként keletkező tetraciklin rezisztens transzformánsokat telep-hibridizáció alapján kiszűrjük mintaként az előbbiekben említett jelzett cDNS felhasználásával. így egy olyan E. coli törzset kapunk, amely egy kb. 10,6 kb nagyságú EcoRI fragmentumot - és ebben a polihedron gént - tartalmaz. Ezt a törzset tenyésztjük és a plazmid DNS-t a céziumkloridos módszerrel tisztítjuk. A tisztított plazmidot pBmE36-nak nevezzük. A pBmE36 plazmidot tartalmazó törzset E. coli K12 JM83 DGB-0036-nak nevezzük és FERM BP-813 számon ezt a Fermentation Research Institute-ben (Agency of Industrial Science and Technology, Japán) helyeztük letétbe. A pBmE36 EcoRI-EcoRI beépített szakaszának restrikciós enzim térképét a 2. ábrán mutatjuk be. A beépített DNS szakaszt tovább vizsgáljuk a Southern hibridizációs módszer segítségével, mintaként az előbbiekben említett jelzett cDNS-t használva fel. A cDNS csak egy Hpal-HindlII fragmentummal (kb. 1,8 kb) volt hibridizálható. C. A polihedron strukturális génszakasz kiküszöbölése. A p9B sorozatba tartozó plazmidok létrehozása C-l A polihedron gént tartalmazó szakasz és az ahhoz képest leszálló irányban elhelyezkedő szakasz klónozása Egy (kb. 3,9 kb nagyságú) HindlII-HindlII fragmentumot - amely az előbbi Hpal-HindlII fragmentumot tartalmazza - és egy (kb. 3,1 kb nagyságú) HindlII-HindlII fragmentumot - amely a polihedron génhez képest egy leszálló szakaszt tartalmaz - beépítünk a kereskedelemben hozzáférhető pUC9; ill. pUC8 klónozó vektorba, azok Hindin helyén. így a p9H18, ill. p8H225 plazmidot kapjuk. C-2 A polihderon génszakasz kiküszöbölése A p9H18 plazmidot EcoRI-vel elbontjuk, majd Bal31-gyel kezeljük, hogy ezáltal leválasszuk a hasítási hely valamelyik oldalának egy részét A Bal31-gyel való kezelés időtartamának változtatásával különböző hosszúságú fragmentumokat állítunk elő. Ezeket Hindlll-vel kezeljük és 0,7%-os agaróz gélben végzett elektroforézissel különítjük el, majd extrakciót végzünk. így különböző vírus DNS fragmentumokat kapunk, amelyek hosszúsága eltérő. A pUC9 plazmidot Smal-vel kezeljük (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke), valamint HindlII-vel, ezt követően pedig ligációt hajtunk végre az előzetesen kapott DNS fragmentumokkal (ezekre egy tompa vég és egy HindlII vég jellemző). A termelt plazmidokkal E. coli K12 JM83-at transzformálunk, majd a mikroorganizmust tenyésztjük, a plazmidokat kinyerjük és mindegyik beépített vírus DNS fragmentum 3’ oldaláról kezdve meghatározzuk a bázis szekvenciát, a didezoximódszer [F. Sanger, Science 214, p. 1205-1210, (1981)] alkalmazásával. Prímért hazsnálunk (az M13 a 15. bázis után következő primerjét) és ily módon azonosítjuk a vírus polihedron génszakaszt. így a vírus DNS finamgnetumok bázis szekvenciái között olyat találunk, amely a poliéderes fehérje Serebriani és mtsai által leírt aminosav szekvenciájának felel meg (1. az előbbiekben), és ugyancsak azonosítjuk a transzlációs ATG start kodont. A különböző plazmidok között - amelyeket a Bal31- gyel való kezelés időtartama függvényében kapunk - p9B241-nek nevezzük azt, amelyből hiányzik a 29. bázispár - a polihedron gén transzlációs ATG start kodonjához képest felszálló irányban - és a poliéderes fehérje strukturális génje (beleértve az ATG-t). Hasonló módon állítjuk elő a p9B sorozatba tartozó plazmidokat Ezek között p9B587-nek, p9B310-nek, p9B276-nak, ill. p9B585-nek nevezzük azt, amelyből 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
