202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
9 HU 202 581 B 10 egy, a Bombyx móriból származó stabilizált sejtvonal .sejtjei például Bm sejtek, amelyeket BM-N sejtként ír le L. E. Volkman és P. A. Goldsmith, Appl. Environ, Microbiol. 44, p. 227-233, (1982) vagy más, BmNPV-vel való fertőzésre érzékeny sejtek) a BmNPV DNS-sel és az értékes anyag termelését kódoló gént tartalmazó rekombináns plazmiddal kereszteződéshez vezet, melynek során a keresett gén (az értékes anyag termelését kódoló gén) átmegy a vírus DNS-be, rekombináns vírus DNS (rekombináns BmNPV DNS) keletkezése mellett. Ezt a rekombinációt egyes esetekben oly módon érjük el, hogy a kívánt gént helyettesítjük be a poliéderes fehérje strukturális gén tartományába, más esetekben pedig oly módon, hogy egy vagy több, az értékes anyag termelésével kapcsolatos gént iktatunk be a vírus DNS másik tartományába vagy másik tartományaiba. Az ilyen in vitro végrehajtott kevert fertőzés a rekombináns vírus DNS elszaporodását és következésképpen a keresett értékes anyag felhalmozódását eredményezi. A közeg tartalmazhatja a nem rekombináns és a rckombináns vírust egyaránt, de a rekombináns vírus egy szokásos módszerrel elkülöníthető [pl. a H. A. Wood, J. Invertcbr. Pathol. 29, p. 304-307 (1977) és az S. Maeda, J. Serie, Sei. Jpn 53, p. 547-548, (1984)] által leírt hígításos módszerrel vagy plakk módszerrel. Az előbbiekben leírt vegyes fertőzések a selyemhernyóban ugyancsak elvégezhetők. Ha Bm sejteket in vitro fertőzünk a Bm sejteken tenyésztett vírussal (vagy a rekombináns és a nem rekombináns vírus keverékével vagy az e keverékből elkülöníted rekombináns vírussal), vagy ha a vírust perkután bevisszük a selyemhernyóba vagy annak testüregébe, hatékonyan termelhetjük az értékes anyagot. A selyemhernyó ezenkívül a szájon át is fertőzhető a vírussal. Az értékes anyag ezt követően megfelelő ismeri módszerekkel - amilyen pl. az affinitás-oszlopkromatográfia, ioncserélő kromatográfia, molekulaszita alkalmazása stb. - elkülöníthető és tisztítható. A találmány szerinti eljárás segítségével ily módon biztonságosan és gazdaságosan, nagy mennyiségekben állíthatunk elő hasznos peptideket, fehérjéket és glukoproteineket. A találmány szerinti eljárás segítségével a peptidcl vagy fehérjét eukarióta sejtekben állítjuk elő. Ezért, ha egy eukariótából származó gént használunk, a termelt pepiid vagy fehérje ugyanolyan átalakulásokon mehet át, amelyek in vivo az eukariótában bekövetkezhetnek (ilyen pl. a szignál pepiid kiküszöbölése és a cukorlánc addíció), úgy hogy a termékek használhatósága várhatóan sokkal jobb, mint a szokásos, baktériumokat alkalmazó géntechnológiai eljárásokkal előállítható termékeké. Ezenkívül ezek a termékek nagyon könnyen tisztíthatók, mivel a sejtekből kiválasztódnak (pl. affinitáskromatográfiával, ioncserélő kromatográfiával, molekulaszitával stb.). Továbbá: az emberiség hosszú tapasztalattal rendelkezik a selyemhernyó-tenyésztés területén és a kísérleti eredmények nagy tömegben halmozódtak fel, így a selyemhernyó nagy léptékben való tenyésztése könnyen végrehajtható. A selyemhernyó ma már mesterséges takarmánnyal is tenyészthető (amilyen pl. a "Vita-Silk”, a Vita-Silk Co., Ltd., Nagoya, Japán) terméke. Ezért az értékes anyagoknak vírus vektorok alkalmazásával az élő organizmus szintjén való termelése feltehetően sokkal megfelelőbb ipari célokra és sokkal gazdaságosabb, mint az ilyen anyagoknak a sejtszinten való előállítása. A következő példákban leírjuk az alfa-interferon (alfa-INF) egy gyógyszerként használható fehéije termelését, az alfa-INF gén mint az értékes anyag termelését kódoló gén alkalmazása segítségével. Ezek a példák további részletek tekintetében illusztrálják a találmány gyakorlati alkalmazásának módját Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a példák semmilyen vonatkozásban sem tekinthetők olyanoknak, amelyek a találmány oltalmi körét korlátoznák. 1. példa A. Klónozás és a BmNPV szaporítása plakk technikával Harmadik lárvaállapotú selyemhernyókat (Bombyx móri) orálisan fertőzünk BmNPV-vel. Néhány nap elteltével a testfolyadékot összegyűjtjük, 1% borjúembrió szérumot tartalmazó TC-10 táptalajjal (J. Invertebr. Pathol. 25, p. 363-370, 1975) hígítjuk és felhasználjuk monoréteg formában tenyésztett Bm sejtek (stabilizált Bombyx móri sejtvonal - amelyet dr. L. E. Volkman, Kaliforniai egyetem, Berkeley bocsátott rendelkezésünkre, ATCC No. CRL-8857, Appl. Environ, Microbiol. 44, p. 227-233,1982) fertőzésére. A fertőzött sejteket 0,75% agarózt és 5% borjúembrió szérumot tartalmazó TC-10 táptalajra rétegezzük. A közeg megszilárdulása után a lemezeket több napon át 27 "C-on inkubáljuk. A lemezen képződött plakkokat Pasteur pipettával elkülönítjük. Ennek a plakk-technikai eljárásnak a kétszeri megismétlése genetikailag homogén vírus izolátumokat eredményez. A további kísérletek során az ilyen vírus izolátumok tekintetében tipikusnak tekinthető BmNPV T3 törzset (Nippon Snashigaku Zasshi, 1984, 53 (4), 341) alkalmazzuk. A BmNPV T3 törzset Bm sejtekben szaporítjuk, majd az 5. lárvaállapotban lévő selyemhernyók fertőzésére használjuk fel, perkután bevitel segítségével. Hat nap múlva a fertőzött szövetet, amely a képződött poliédereket tartalmazza, desztillált víz hozzáadása után centrifugáljuk és az üledéket desztillálát vízben szuszpcndáljuk, majd eldörzsöljük. A poliédereket frakciónál! centrifugálással (3000 ford/pcrc, 30 perc) és szakaszos sűrűség-gradiens centrifugálással (45 és 55 tömeg/tömeg%os szacharóz oldatok, 20 000 ford/perc, 30 perc) tisztjük. A polihedron szuszpenziót a szacharóz oldat eltávolítására frakcionált centrifugálásnak vetjük alá (3000 ford/perc, 10 perc), a tisztított polihedronokat pedig 0,1M nátriumkarbonát (pH 11) - 0,05M nátrium-klorid elegyben szuszpendáljuk és 30 percen át 25 'C- on tartjuk. Ezzel a vírusrészecskék kiszabadulását idézzük elő. A vírus szuszpenziót tisztítás céljából 10-40 tömeg/tömeg%-os szacharóz oldatok alkalmazásával sűrűség-gradiens centrifugálásnak (18 000 ford/perc, 30 perc) vetjük alá. A szacharózt dialízissel vagy ftakcionált centrifugálással (40 000 ford/perc, 30 perc) távolítjuk el; így tisztított vírus részecskéket kapunk. B. A vírus DNS előállítása, a polihedron gén azonosítása és klónozás B-l A vírus DNS extrakciója Az így kapott, a vírust tartalmazó oldathoz SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát) (1 tömeg/tömeg%) és proteáz K-t (Merck, 1 mg/ml) adunk. 37 *C-on kb. 2 órán át végzett inkubálás után ehhez az oldathoz azonos térfo5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
