202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
7 HU 202 581 B 8 felhasználásával végezhetők el, a Mól. Clon-ban (149— 268. old.) leírt módon. Értékes anyagok előállításával kapcsolatban számos gént írtak le és várható, hogy a jövőben számos természetben előforduló gén elkülönítése és ezen és más géneknek szintézise válik majd ismertté. Könnyen érthető, hogy a találmány gyakorlati alkalmazása keretében minden ilyen gén felhasználható. Az értékes anyagok biológiailag aktív anyagokat jelentenek, amilyenek pl. a következők: peptidek, fehérjék és glukoproteinek - pl. timföldnek, amilyen az alfa-interferon, beta-interferon, gamma-interferon, a TNF (tumor necrosis foctor) és az interleukinck, hormonok (pl. az inzulin és a humán növekedési hormon), vakcinák (pl. a humán hepatitis A és B vakcinák), valamint az influenza vakcinák és más anyagok (pl a TPA, szomatomedinek, telepképződést stimuláló faktorok). Általában úgy járhatunk el, hogy a transzlációs start kodon ATG szakaszát hozzákapcsoljuk ezekhez a génekhez, mielőtt a következő eljárási lépéseket lefolytatnánk. Ezután egy rekombináns plazmidot állítunk elő oly módon, hogy egy, a hasznos anyag termelésével kapcsolatos gént és egy többszörös kötődést biztosító DNS szakaszt - amely mindkét végéhez csatlakozva az EcoRI, Smal, BamHl, Sáli és PstI restrikciós helyeit tartalmazza - beépítünk a vektorba. A rekombináns plazmid előállításához bármely más megfelelő, szokásos módszert is alkalmazhatunk, amilyeneket a Mól. Clon. p. 392-393 helye leír. Az így kapott rekombináns plazmid következésképpen a következőket tartalmazza: a vírusból leszármaztatható fragmentumokat - nevezetesen a promoter tartományt tartalmazó DNS fragmentumot, a transzlációs stop kodontól kiinduló leszálló fragmentumot az értékes anyag termelésével kapcsolatos exogén génhez képest felszálló és leszálló irányban valamint az exogén gént Az előbbiekben említett eljárási lépések során a DNS fragmentum beillesztése során a bázis szekvencia megfordulása következhet be. Ezért természetesen minden lépésben - mielőtt a következő lépésre áttérnénk - meg kell győződnünk arról, hogy a bázis szekvencia a leolvasás szempontjából megfelelő irányú. Az előbbi módon előállított rekombináns plazmid Önmagában alkalmazható az E. coli transzformációjára és abban szaporítható. Nem mindig van szükség arra, hogy a promoter tartományt tartalmazó 5’-felszálló fragmentum megőrizze a BmNPV DNS-ben eredetileg megtalálható bázis szekvenciát. Hasonló expressziós arány várható akkor is, ha a fragmentum többé-kevésbé módosult. A jellegzetes TATA box, amely a promoter tartományban állítólag jelen van, általában nem azonosítható egyértelmű módon a BmNPV DNS-nek abban a szakaszában, amely a poliéderes fehérje strukturális génje ATG-étől felszálló irányban helyezkedik el. Amint azonban a következő C-2 példában és az ezt követő példákban, valamint az 1. táblázatban erre rámutattunk, az ATG-től felszálló irányban előforduló bizonyos rendellenességek, pl. a -7 —1 bp, -18 —1 bp és -19 —1 bp között fellépő hiányok nem befolyásolják lényegesen azt a kiváló eredményt, amely az ilyen kihagyások nélkül elélhető. Megfelelő eredményt kaphatunk a -29 —1 bp közötti hiány esetében is. Viszont a -82 - -1 bp közötti hiány esetében tendencia észlelhető egy jóval alacsonyabb hatásfok irányában. Ezért úgy tűnik, hogy az ATG-től számított -80 bázis környéke már egy jelentős promoter tartományt foglal magában. Az 5’-felszálló DNS hosszúsága, amely a promoter tartomány és egy, a vírus DNS rekombinációja szempontjából hasznos felszálló DNS kombinációjából áll, változó lehet. Hosszúsága pl. elérheti a több száztól a tíz kilobázispár nagyságrendet az ATG-t megelőző részben. Közelebbről: kielégítő eredményeket kapunk, mint ezt a későbbiekben kifejtjük, ha a Hpal-HindlII fragmentumnak (kb. 1,8 kb) azt a tartományát használjuk, amely az ATG-hez képest felszálló irányban helyezkedik el vagy a Hindlü-HindlII fragmentumnak (kb. 3,9 kb) azt a szakaszát, amely az ATG-hez képest felszálló irányban található, vagy ennek egy részét alkalmazzuk. Nyilvánvalóan nem lényeges, hogy az 5’-felszálló DNS egy további tartományt tartalmazzon a kb. 3,9 kb nagyságú fragmentumhoz képest felszálló irányban. Mint az előbbiekben már említettük, a promoter tartomány abból a szempontból jelentős, hogy a BmNPV DNS kiváló fehérjetermelő képességét kihasználhassuk. A promoter tartományhoz képest felszálló irányban elhelyezkedő DNS szekvencia és a poliéderes fehérje strukturális génjéhez képest leszálló irányban elhelyezkedő 3’-leszálló DNS szekvencia kulcsszerepet játszik a rekombináns vírus oly módon történő előállítása esetén, hogy egy, az értékes anyag termelését kódoló gént (az értékes anyagot kódoló exogén gén transzlánciós start kodonjával együtt) a későbbiekben leüt módon beiktatunk a BmNPV DNS-be. így a vegyes fertőzés a BmNPV DNS-sel és egy transzfer rekombinációs DNS- sel (pl. plazmiddal) - amelyben jelen van egy DNS fragmentum és ebben egy, az értékes anyagot kódoló gén és ettől a géntől számítva felszálló és leszálló irányban olyan DNS szekvenciák, amelyek a BmNPV DNS megfelelő ellentett részei homológjainak tekinthetők - kereszteződést eredményez, amelynek során az értékes anyagot kódoló gén átmegy a BmNPV DNS-be a kulcsfontosságú szakaszokban fennálló homológia folytán, és rekombináns BmNPV DNS keletkezik. A poliéderes fehérje strukturális génjétől felszálló és leszálló irányban elhelyezkedő megfelelő DNS szekvenciák meghatározása, módosítása és hasznosítása nem jelenthet nehézséget a szakember számára; ennek alátámasztására hivatkozunk az előbbi és a következő leírásra, valamint a példákra. A szakember a vonatkozó technikai megoldásokat - bármilyen részletesek is legyenek azok - megértheti és egyszerű rutin kísérletek segítségével a gyakorlatban megvalósíthatja. Meg kell jegyeznünk, hogy minden, ily módon a gyakorlatban megvalósítható foganatosítási mód a találmány oltalmi kikébe tartozik. Az előbbiekben említett rekombináns plazmid előállítását követően különböző módszerek alkalmazhatók annak érdekében, hogy ennek felhasználásával olyan rekombináns BmNPV DNS-t állítsunk elő, amely tartalmazza az értékes anyagot kódoló gént Egy ilyen módszer pl. in vitro hajtható végre, míg egy másik a selyemhernyót használja fel. Egy további foganatosítási mód szerint nem ezt a rekombináns plazmidot alkalmazzuk, hanem rekombinánst állítunk elő a BmNPV DNS és a pBR322 vagy egy hasonló plazmidból és a rekombinánsban a polihedron gént egy rekombináns vírus DNS keletkezése közben helyettesítjük egy olyan génnel, amely az értékes anyag termelését kódolja. Sejttenyészetek in vitro kevert fertőzése (ilyenek pl. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
