202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
5 HU 202 581 B 6 restrikciós enzimekkel végzett hasítással állíthatjuk eló - amelyet a szóban forgó DNS szekvenciák meghatározása követ illetőleg a kémiai szintézishez folyamodhatunk, amint ezt A. D. Riggs és K. Ilakúra (Am. J. Hum. Genet 31,531-538,1978) leírja. A selyemhernyóban képződő BmNPV poliéderes fehérjéjének 244 aminosavból álló szekvenciáját S. Sercbriani és mtsai (J. Invertebrate Pathology 30, 442^443, 1977) elemezték és írták le. Ezért ellenőrizni tudjuk - pl. a poliéderes fehérje aminosav-szekvenciája alapján -, hogy egy, a BmNPV-ből származó DNS-fragmentum a polihedron gén melyik szakaszának felel meg. Annak eldöntésére, hogy a fragmentum nem a géntartományból, hanem egy másik tartományból származik-e, meghatározzuk a fragmentum bázis-szekvenciáját, e bázisszekvencia alapján létrehozunk egy aminosav-szekvenciát - a kodon-aminosav megfelelőségi szabály szerint -, és az így kapott aminosav-szek véne iát összehasonlítjuk a Serebriani és mtsai által leírttal 0- feljebb). A feltalálók megbizonyosodtak arról, hogy a polihedron gén eltávolítására, valamint a felszálló és leszálló DNS fragmentumok hasznosítására egy kb. 10,6 kbp-es, EcoRI-vel való hasítás útján előállítható BmNPV DNS fragmentum alkalmas leginkább, és hogy a fragmentum HindlII-vel (a Takara Shuzo Co., Ltd. terméke) való elbontása két olyan fragmentumot szolgáltat, amelyek előnyösen alkalmazhatók. Ez a fragmentum azonban nem az egyetlen termék, amellyel a találmány célkitűzései elérhetők. Használhatók más megfelelő fragmentumok is, amelyeket különböző restrikciós enzimek alkalmazásával történő teszteléssel kaphatunk. A találmány leírásában, ha ez helyénvaló, szemléltetés céljából az előbbiekben leírt megfelelő fragmentum esetére fogunk hivatkozni. A DNS szekvenciákat, hacsak másként nem jelezzük, a szokásos módon fogjuk leírni. így az 5’-véget a bal oldalon adjuk meg és a 3’-véget a jobb oldalon, és a restrikciós enzimmel végzett hasítással kapott fragmentumot a restrikciós enzimek neve közöu álló kötőjel jelöli. A bal és a jobb oldal jelentése ekkor is az előbb említettel azonos. A fenti fragmentum pl. az alábbiakban összegezhető: EcoRI Hindin Hnal Hindin BamlIT Hindül F.coRI n 1.8 kb 3.9 kb 3,1 kb 10,6 k1 3 A poliéderes fehérjét kódoló génszakasz oly módon határozható meg, hogy az előbbi fragmentumot kisebb fragmentumokra bontjuk. Ezt a műveletet pl. Southern hibridizálásos vizsgálat követi. így az előbbi esetben a kérdéses strukturális gén jelenléte egy Hpal-HindlII fragmentumban (kb. 1,8 kb) állapítható meg. A Hpal-ta Takara Shuzo Co., Ltd. állítja elő. Hivatkozás céljából a 3. ábrán mutatjuk be a Hpal-HindlII fragmentum egy részének szekvenciáját (a Hpal hasítási helyétől leszálló irányban 201-nél található bázistól a HindlII hasítási helyig - 1567 bp - 382-1185 között az ATG starthelyre vonatkoztatva, amely itt ugyanaz). A strukturális géntől felszálló és leszálló irányban elhelyezkedő szakaszok hasznosítására ezért két fragmentumot célszerű használni: a HindlII-vel való kezeléssel előállított HindlII-HindlII fragmentumot (kb. 3,9 kb) és a HindlII-HindlII fragmentumot (kb. 3,1 kb). Ez a két fragmentum hagyományos módszerekkel különíthető el, amilyen az agaróz elcktroforézis (Mól. Clon., p. 164-167.). Az így izolált két fragmentum egyszerűen manipulálható oly módon, hogy ezeket külön-külön mesterséges kapcsolóelemeket tartalmazó plazmidokba építjük be. Erre a célra megfelelő pl. a pUC9 és a pUC8 plazmid, amely a kereskedelemben hozzáférhető (Pharmacia P-L BIOCHEMICALS, 4-5-37 Kamiosoki, Shinagawa-ku, Tokyo 141, Japán). A HindlII-HindlII fragmentumot (kb. 3,1 kb), a leszálló oldalról használjuk fel oly módon, hogy ezt bevisszük a pUC8 plazmidba, ennek a HindlII helyén. A felszálló oldali HindlII-HindlII fragmentumot - amely a poliéderes fehérje génjét tartalmazza - a pUC9 plazmidba építjük be, ennek a Hindin helyén. A beépítés termékét egy helyen egy restrikciós enzimmel (pl. EcoRI-vel) hasítjuk és az így kapott DNS fragmentumot Bal31-gyel (Bethesda Research Laboratories, USA) végzett elbontásnak vetjük alá. Ennek során a DNS lánchosszúsága egyszerűen beállítható, mivel a Bal31 a bázisokat egyenként hasítja le, a bontási helytől számított mindkét irányban. Ha több különböző hosszúságú fragmentumot állítunk elő, a kezelési idő változtatásával, és analizáljuk bázis-szekvenciájukat, meghatározhatjuk - annak alapján, hogy ismeijük a bázispárokat a polihedron gén DNS szekvenciájában -, hogy melyik az a fragmentum, amely nem tartalmazza a polihedron gént Miután az előbbi módon eltávolítottuk a polihedron gént, egy olyan DNS fragmentumhoz juthatunk amely a vírusból származó, a génhez képest felszálló irányban található promoter szakaszt tartalmazza. Ezt a fragmentumot egy vektor plazmid előállítására használhatjuk fel egy olyan DNS fragmentummal kombinálva, amely a polihedron génhez képest leszálló irányban található és amely ugyancsak az előbbiekben ismertetett gén-elimináció keretében férhető hozzá oly módon, hogy egy, valamely hasznos anyag termelésével kapcsolatos exogén gént iktatunk be az említett két fragmentum közötti helyen. Ez az a hely, amelyen korábban a polihedron gén vol t jelen. így pl. a HindlII-mal való kezelés után a felszálló szakaszt beiktatjuk a pUC9 plazmidba - egy plazmid előállítására-, míg a leszálló tartományt Hindül--HindlII fragmentum (kb. 3,1 kb) alakjában beiktatjuk a pUC8 plazmidba, a HindlII helyen, egy másik plazmid előállítására. Ezután, felhasználva azt a körülményt, hogy a restrikciós enzimhelyek az említett két plazmidban megegyeznek, egy további plazmidot hozunk létre, amely mind a felszálló, mind a leszálló tartományt tartalmazza, mintha ezeket ugyanabba a plazmidba ültettük volna be. Ebben az esetben olykor ajánlatos egy, az értékes anyaggal kapcsolatos gén beültetését úgy megtervezni, hogy a két szakasz között rendelkezésre álljon egy mesterséges kötési tartomány. Más szokásos eljárásokat is alkalmazhatunk a DNS szekvenciáknak plazmidokba való beépítésére. Ha kihagyásokat állapítunk meg a polihedron gén transzlációs start és transzlációs stop kodonjában és ekörül a következőkben megadott DNS szekvenciához képest, ezek kitölthelők oly módon, hogy kiegészítő jelleggel szintetikus DNS-t adagolunk, vagy in vitro mutagenezist hajtunk végre a K. Itakura et al. [Nucleic Acid Res. 9, p. 3647-3656, (1981)] által leírt módszerrel. Ezek a javítások a hagyományos DNS technikák 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
