202581. lajstromszámú szabadalom • Eljárás értékes fehérjeanyagok előállítására rekombináns Bombyx mori polihedrózis vírus DNS alkalmazásával
3 HU 202 581 B 4 - eljárás az előbbiekben említett rekombináns BmNPV DNS előállítására azzal jellemezve, hogy a rekombináció helyettesítést jelent a poliéderes fehéije gén tartományában étvágy beültetést egy, a poliéderes fehérje génje által elfoglalttól különböző tartományban;- eljárás értékes anyagok géntechnológiai módszerekkel történő előállítására azzal jellemezve, hogy vektoronként a BmNPV DNS-t használjuk és- eljárás értékes anyagok géntec hnológiai módszerekkel történő előállítására azzal jellemezve, hogy egy 5’-fclszálló BmNPV DNS szakaszt - amely eredetileg a poliéderes fehéije strukturális génjéhez képest felszálló irányban helyezkedik el és még magában foglalja a strukturális gén promoter tartományát-és egy 3’-leszálló BmNPV DNS szakaszt alkalmazunk, amely utóbbi eredetileg a strukturális génhez képest leszálló irányban helyezkedik el. Az 1. ábra egy pIFN-lB plazmid széria - mely a rekombináns BmNPV DNA előállítására alkalmazható- felépítését mutatja be. A 2. ábra a pBmE36 EcoRI-EcoRI fragmentuma restrikciós enzim tétképét ábrázolja. A 3. ábrán a Hpal-HindlII fragmentum egy részének bázis szekvenciáját mutatjuk be. A 4. ábrán a bázis szekvencia látható a polihedrális gén ATG részének szomszédságában. Az 5. ábra egy kapcsolásos szintézis vázlatát ábrázolja. A 6. ábra egy, a pBMO30 előállítására irányuló eljárást illusztrál. A 7. ábra a pBMO30 restrikciós enzim térképe, amely a bázis szekvenciát mutatja be ennek sokszoros kötődési tartományában, valamint az enzim hasítási helyeit A 8. ábrán eljárás látható pIFN 2 BN sorozatú plazmidok előállítására. A 9. ábra tárgya: eljárás pBM034 előállítására. A találmányt a következőkben azzal tesszük érthetőbbé, hogy leírjuk a jellegzetes foganatosítási módokat A BmNPV a baculovfrus csoporthoz tartozó rovarvírusok egyike. Gazda-specifikussága magas fokú és a selyemhernyót (Bombyx móri) úgy fertőzi meg, hogy eközben nagy mennyiségekben poliéderes fehérje halmozódik fel a Bombyx móri sejtfalában. Ez a vírus kétágú körkörös DNA genommal (kb. 140 kbp) jellemezhető és ez a DNS a szokásos technikák alkalmazásával nyerhető ki a vúrusrészecskékből. Ilyen pl. a pro' teázzal, nátrium-laurilszulfáttal (SLS) végzett kezelés és az extrakció stb., amelyet G. E. Smith és M. D. Summers ír le (virology 89, p. 517-527, 1978.). Ez a kétágú körkörös DNS (amelyet a továbbiakban röviden vírus DNS-nek vagy BmNPV DNS-nek fogunk nevezni) meglehetősen nagy körkörös DNS. Ezért a felhasználásra előnyösen egy kisebb DNS fragmentumot választunk ki, amely tartalmazza a poliéderes fehéije szerkezeti génjét és a gént megelőző és követő szakaszokat (5 ’ -felszálló és 3’-leszálló szakasz), a restrikciós enzimmel való kezeléssel kapott DNS fragmentumok közül. Különböző restrikciós enzimeket ismerünk és szerezhetünk be a kereskedelemben. Ezért könnyen kiválaszthatjuk az előbbi célra megfelelőt vagy megfelelőket. Az alkalmazott enzimtől vagy enzimektől függően a megfelelő körülményeket úgy határozhatjuk meg, amint ezt T. Maniatis és mtsai leírják (Molecular Cloning, ezután Mol. Cion., Cold Sprin Harb«- Laboratory, 1982, p. 97-148.) A DNS fragmentumok szintézisét (kémiai szintézis, hasítás restrikciós enzimmel vagy enzimekkel), elkülönítését és kimutatását, a DNS szekvencia elemzését és az E. coli kezelését (transzformáció, tenyésztés, plazmid visszanyerés stb.) - amelyet a találmány magában foglal - jól ismert géntechnológiai módszerekkel végezhetjük, amilyeneket A. D. Riggs és K. Itakura (Am. J. Hum. Genet 31, p. 531-538,1979) és a Mól. Clon. leír (55-402. old.). Ha ki akarunk választani egy strukturális gént tartalmazó DNS fragmentumot a nagyszámú DNS fragmentum közül, amelyet a BmNPV-ből Southern hibridizálással állítottunk elő (Mól. Clon. p. 382-389), egyebek között hasznos lehet egy, a szokásos módon elkészített minta alkalmazása. A kiválasztandó fragmentumoknak tartalmazniuk kell a strukturális génszakaszt, de emellett fontos az is, hogy a fragmentum ugyancsak tartalmazzon egy meglehetősen hosszú DNS-láncot az 5’-oldalon (felszálló oldalon), és egyes esetekben egy ilyen DNS- láncot a 3’ -oldalon is (leszálló oldal). Az egyes láncok hosszúsága a keresett hasznos anyag termelésének hatékonysága szempontjából fontos. Bár a kezelhetőség egyszerűsége ugyancsak fontos tényező, mint a következőkben erre rámutatunk, egy adott lánchosszúság megfelelő vagy nem megfelelő volta kísérletileg határozható meg. A DNS megfelelő hosszúságát a következők szerint határozzuk meg. Az 1. példában leírt módon különböző lánchosszúságú DNS fragmentumokkal rekombináns vírusokat alakítunk ki, amelyek tartalmazzák az értékes anyag termeléséért felelős gént, pl. az a- IFN (alfa-interferon) gént. Ezután a sejttenyészetet megfertőzzük ezekkel a rekombináns vírusokkal az értékes anyag termelési intenzitásának összehasonlítására. A következő leírásban, és különösen a példákban található útmutatásokat betartva a szakember nem találkozik komolyabb nehézségekkel az ilyen vonatkozásban szükséges kísérletek végrehajtása során, bár valamennyi időre és munkára szükség van. Bár a kb. 10,6 kbp értékű fragmentum - amelyet EcoRI-vel (a Takara Shuzo Co., Ltd. (Shijo higashinotouin Higashiiru, Shimogyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto 600-91 Japán) terméke) való hasítással állíthatunk elő - egyike az erre a célra megfelelő fragmentumoknak, számos más fragmentum - pl. a Clal-Clal, Pstl-PstI stb., amelyek más restrikciós enzimek alkalmazásával állíthatók elő - ugyancsak alkalmazható. A Clal-t a New England Biolabs - Amerikai Egyesült Államok -, a Pstl-t pedig a Takara Shuzo Co., Ltd., - Japán - állítja elő. Különböző technikákat alkalmazhatunk, ha a strukturális génszakaszt ki akarjuk küszöbölni egy fragmentumból, amely a poliéderes fehéije strukturális génjét, valamint az ezt megelőzd és követő DNS-láncokat tartalmazza és a későbbi felhasználásra el akarunk távolítani egy megfelelő hosszúságú DNS-láncot, amely a strukturális génhez képest a felszálló oldalon tartalmazza a promoter tartományt, és adott esetben egy megfelelő hosszúságú DNS-láncot, amely eredetileg a strukturális génhez képest leszálló irányban helyezkedik el. A különböző restrikciós enzimekkel kapott fragmentumokat megvizsgáljuk a DNS szekvenciáját meghatározzuk, és ily módon a strukturális géntartományt azonosítjuk, hogy a strukturális gént kiküszöbölhessük exonukleázokkal (pl. Bal31 vagy exonukleáz III) végzett elbontás segítségével. A szükségessé váló felszálló és leszálló DNS-láncot pl. a Bal31-gyel végzett elbontás után visszamaradt részek közül választhatjuk ki, vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
