202579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentációban felhasználható mikroorganizmusok vagy mikroorganizmus-részek gélbe zárására
1 HU 202 577 B 2 A találmány tárgya eljárás fermentációban felhasználható mikroorganizmusok vagy mikroorganizmus-részek gélbe zárására. Ismert, hogy a fermentációs műveletekben igen előnyösen használhatók fel rögzített mikroorganizmusok vagy mikroorganizmus-részek, például fermentációra alkalmas spóraszuszpenziók, sejttörmelékek, légmicéliumok, teljes vegetatív sejttenyészetek vagy növekedésben lévő tenyészetek. A rögzítés célja az, hogy a mikroorganizmusokat vagy mikroorganizmus-részeket (amelyek a fermentációhoz szükséges biokatalizátorokat szolgáltatják) a reaktortérben lokalizálja, és meggátolja, hogy azok az áramló fázisba kerüljenek át. Rögzített mikroorganizmusok, illetve mikroorganizmus-részek alkalmazásával javítható a biokatalizátor stabilitása (élettartama), növelhető a katalizált reakció térfogati termelékenysége, és a fermentáció folyamatos üzemmódban is megvalósíthatóvá válik. A rögzítés egyik lehetséges módszere a biokatalizátomak szálak vagy gélek üregeibe történő bezárása. Erre a célra szintetikus gélek (például poli-akrilamid) vagy természetes eredetű gélképzők alkalmazhatók. Ismert például, hogy a Penicillium chrysogeneum-konidiumok, -micéliumok és -protoplasztok gélbe zárt állapotban is felhasználhatók penicillin G bioszintéziséhez. A bezáráshoz a Biotechnoi. Bioeng. 26,318 (1984) közlemény szerint K-karragenátot, a Biotechnoi. Bioeng. 21, 261 (1979) közlemény szerint poli-akrilamidot, az Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnoi. 15, 211 (1982) közlemény szerint kalcium-alginát gélt használnak. Az Eur. J. Appl. Microbiol. 2, 153 (1976) közlemény poli-akrilamidba bezárt Escherichia coli sejtek használatát ismerteti 6-amino-penicillánsav előállításában. A Biotechnoi. Lett 4, 293 (1982) közlemény szerint 6-amino-penicillánsav előállításához kitozánba bezárt Pleurotus ostreatus-sejteket használnak. A Biotechnoi. Bioeng. 23, 2747 (1981) közlemény poli-akrilamidba bezárt Streptomyces clavuligerus sejtek felhasználását ismerteti cefalosporin C előállításában. Az Antimicrob. Agents Chemother. 15, 126 (1979) és Biotechnoi. Bioeng. 22, 1015 (1980) közlemények szerint poli-akrilamid gélbe zárt Bacillus sp. baktériumsejtekkel bacitracint lehet termeltetni. Az Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15, 206 (1982) közlemény kalcium-alginátba rögzített Streptomyces sejtek felhasználását ismerteti tilozin és nikkomicin termelésében. A Biotechnoi. Lett. 5, 125 (1983), és 5, 785 (1983) közlemények szerint K-karragcnátba zárt Penicillium urticac konidiumok patulin glükózból történő előállítására alkalmazhatók. A fenti ismert eljárások hátrányai a következők: A poli-akrilamid gélbe történő bezárásnál a gélesedés során keletkező szabad gyökök súlyos sejtkárosodást okoznak, illetve egyes enzimekre gátló hatást fejtenek ki. Az ionotróp gélképzők, így például az alginátok és karragenátok esetén a gélesítéshez szükséges fémionok citotoxikusak lehetnek. Ezért ezek az eljárások a fermentációs célokra alkalmas mikroorganizmusok, illetve mikroorganizmus-részek csak egy szűk körénél alkalmazhatók eredményesen. Célszerű megoldás lenne a fermentációra alkalmas mikroorganizmusokat, illetve mikroorganizmus-részeket agar-gélbe zárva rögzíteni. Az agar-gél ugyanis - ami a mikroorganizmusok tenyésztésére használt táptalajok leggyakoribb komponense - a mikroorganizmusokra semmiféle káros hatást nem gyakorol, biztosítja az élő sejtek és spórák számára az optimális feltételeket, és a gélhálózat is megfelelő a micélium in situ kifejlődéséhez. Mikroorganizmusok agar-gélbe zárását ismerteti a Biotechnoi. Bioeng. 17, 1729 (1975) és a Microbiologiya 49,479 (1980) közlemény. Az ott közöltek szerint 2-4%-os vizes agar oldatot a gélesedési hőmérséklethez közel cső hőmérsékletre hűtve Escherichia coli, illetve Methylomonas sejtszuszpenzióval homogenizálnak, és a homogenizátumot hideg desztillált vízbe vagy foszfátpufferbe csepegtetik, vagy tömb fomájában dermedni hagyják és utólag aprítják. A megoldás hátránya, hogy a vízbe csepegtetett gél változó méretben és alakban dermed meg. Az így képződött, rendkívül heterogén alakú (szál-, félgömb- vagy szabálytalan formájú) és méreteloszlású gélrészecskék felhasználása fermentációs célokra nem előnyös, mert nem teszik lehetővé a közeg egyenletes áramoltatását, a részecskék átsodródhatnak az áramló fázisba, és elkülönítésük nehézkes. A megdermedt agar-géltömbök aprítása időigényes, nehézkes művelet A fermentációs célokra optimálisan felhasználható, szabályos gömb alakú, szűk mérettartományba eső átmérőjű gélrészecskék ezekkel a módszerekkel nem állíthatók elő. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a képződő gélrészecskék alakja és mérete szempontjából döntő szerepe van a gélképzés közegeként felhasznált folyadék fizikai jellemzőinek. Tapasztalataink szerint szabályos gömb alakú, szűk mérettartományba eső (rendszerint 1-5 mm méretű) gélrészecskék akkor állíthatók elő, ha a fermentációs célokra használt mikroorganizmus vagy mikroorganizmus-részek 45-50 ‘C hőmérsékletű folyékony agar-oldattal képezett keverékét olyan, a mikroorganizmust nem károsító szerves oldószerbe vagy oldószer-elegybe csepegtetjük, amelynek vízben való oldhatósága 0,03-10 g/100 g, sűrűsége 0,6- 1,2 g/cm3, 20 *C-on meghatározott viszkozitása 0,45- 10 cP, forráspontja 75-250 ‘C, és amelyben a cseppek ülepedési sebessége 0,01-10 cm/sec. A leírásban és az igénypontsorozatban a „fermentációra alkalmas mikroorganizmus vagy mikroorganizmusrész” megjelölésen az adott mikroorganizmusnak fermentációs célra felhasználható összes lehetséges formáját, így például a mikroorganizmus vegetatív tenyészetét, spóraszuszpenzióját, izolált sejtjeit, konidiumait, micéliumait, sejttörmelékeit, növekedésben lévő tenyészeteit, sejtkomponenseit stb. értjük. A gélképzés közegeként felhasznált szerves oldószer vagy oldószer-elegy vízben való oldhatósága célszerűen 0,1-10 g/100 g, sűrűsége pedig célszerűen 0,8- 1,1 g/cm3 lehet. További alapvető követelmény, hogy a szerves oldószerbe csepegtetett gélcseppek ne lebegjenek a szerves oldószerben; a cseppek ülepedési sebessége célszerűen 0,05-10 cm/sec. A találmány szerinti eljárásban a gélképzés közegeként például etil-acetátot, izooktanolt, n-butil-acetátot, n-amil-alkoholt, benzil-alkoholt, acetecetésztert, a felsorolt oldószerek keverékeit, vagy 10 térfogat% metil-izobutil-ketont tartalmazó acetecetésztert használhatunk. A gélgyöngy-képződés gyorsítása céljából a gélképzés közegét célszerűen 0-10 'C-ra hűljük. Kívánt esetben a gélképzés közegébe lassú ütemben inert gázt vezethetünk annak érdekében, hogy megakadályozzuk a gélgyöngyök egymáshoz tapadását. A képződött gél-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
