202578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csontvelősejtek replikálására három dimenziós sejttenyésztő rendszerben, három dimenziós támasztó anyag a rendszerhez, és eljárás citotoxicitás vizsgálatára ezen rendszer segítségével
7 HU 202 578 B 8 növesztünk a hálón, amíg el nem érik az összefolyást. Mind a hematopoietikus, mind a sztrómális csontvelősejteket tartalmazó keveréket azután az összefolyó, növekedést fokozó fibroblaszt hálózatra inokuláljuk. A növekedést fokozó fibroblasztok növesztésére, szelektálására ésfagyasztásos tárolására szolgáló módszerek az alábbiak: a) A növekedést fokozó fibroblasztok tenyésztése. Fibroblasztokat növesztünk 2-10% borjúembrió szérummal és 2-10% lószérummal kiegészített RPMI 1640-ben, amelyhez 1 ßg/ml hidrokortizon hemiszukcinátot és 2 jxg/ml gentamicint adtunk. Tenyészeteket növesztünk 5% C02-t tartalmazó környezeti levegőben 37 °C hőmérsékleten, 90%-nál nagyobb relatív nedvességtartalomnál. b) Növekedést fokozó fibroblasztok kiválasztása. 5-106 csontvelő szuszpenziő „buffy coat” frakciójából származó fibroblasztot, bőr-fibroblasztot vagy hullamájakból származó fibroblasztot mikrotitráló lemezek üregeibe (1 mm2) helyezünk, és összefolyásig növesztjük. Ezeket a sejteket a tenyésztő üregekből ismételt mosással szedjük le, általában 4-5 mosással, Hank-féle Ca** és Mg** nélküli kiegyensúlyozott sóoldattal. A mikrotitráló lemezen maradó mátrixot megvizsgáljuk indirekt immunfiuoreszcenciával, a különböző mátrix komponensekhez tartozó monoklonális antitesteket és fluoieszcein-izotiocianáttal jelzett nyúl anti-egér immunglobulin G-t alkalmazva, hogy meggyőződjünk, jelen van-e a megfelelő kollagén típus. A szuszpendált sejteket az 1-1V kollagén típusok, elasztin, tropoelasztin és fibronektin ellen irányuló monoklonális antitestekkel kezeljük, hogy olyan sejtek al-populációját izoláljuk, amely képes az egyes termékeket szintetizálni. A sejteket tengerimalac komplementtel kezeljük, amely károsítja vagy elroncsolja azokat a sejteket, amelyekhez monoklonális antitest kötődik. Az élő sejteket újra mikrotitráló lemezek üregeibe helyezzük, amint korábban leírtuk, összefolyásig növesztjük és leszedjük onnan. Az izolálási technika hatékonyságát azután az ezek által a sejtek által kiválasztott mátrix vizsgálatával igazoljuk, monoklonális antitestekkel és közvetett immunfluoreszcenciával. A hematopoietikus sejtek optimális növekedéséhez a mátrixnak III, IV és I kollagén típusokat kell tartalmaznia, mintegy 6:3:1 arányban. c) Növekedést fokozó fibroblasztok fagyasztásos tartósítása (krioprezerválása). A növekedést fokozó fibroblasztokat fagyasztásos tartósításnak vethetjük alá, ugyanazokat a technikákat alkalmazva, mint amelyeket korábban a sztrómális sejtekhez leírtunk. A sztrómális sejtekhez hasonlóan a növekedést fokozó fibroblasztok közül néhány leválik a hálóról a fagyasztás során. Ez a mátrix azonban még a csontvelő sztrómális sejtjeinek kötéséhez járul hozzá és ezért csökkenti azt az időt, amely a hematopoietikus sejt növesztéshez vezető mátrix létrehozásához szükséges. Inokulálás mononukleáris sejtekkel. Abból a célból, hogy fokozzuk a csontvelőtenyészetek hosszú idejű növesztését, perifériás vér mononukleáris sejteket készítünk heparinizált szuszpenzióból, Ficoll-Hypaque-t vagy Percoll-t alkalmazva. A perifériás vérsejtek és a csontvelő hematopoietikus sejtek ugyanabból az egyénből származnak (autológok). Ezeket vénapunklúrával kell eltávolítani és akkor kell fagyasztva tartósítani, amikor a csontvelőmintát vesszük. További perifériás vérsejteket szerezhetünk be a betegből, ha szükséges, tenyésztési eljárással. Ha azonban áttételes betegség gyanítható, a mintát először tisztításnak kell alávetni, mint korábban említettük. 5 x 10s - 106 mononukleáris sejtet (a monocita al-populáció az előnyös sejttípus a mononukleáris sejtrétegen belül ennél a lépésnél) inokulálunk a hálózatra 4-5 nappal a csontvelő hematopoietikus sejtekkel végzett kezdeti inokulálás után, majd ezután minden harmadik héten. Ez az eljárás 10-13%kal növeli a hematopoiezist, amint a heti vizsgálatok alapján megfigyeljük. A tenyészet fenntartása és a progenitor sejtek tárolása Tapasztalataink szerint az összefolyó sztrómális sejttenyészetek nem támogatják a hematopoiezist, vagy legfeljebb csak nagyon gyengén támogatják. A humán hematopoietikus progenitorok korlátlan növesztése akkor lehetséges, ha a szükséges sztrómális eredetű növekedési/szabályozó faktorokat is szolgáltatjuk. így pl. a kezdeti csontvelőmintát alikvotok sorozatára osztjuk szét, amelyek mindegyike 106 hematopoietikus sejtet tartalmaz. Ezek mindegyikét összefolyó sztrómális sejthálózatra inokuláljuk. A tenyészeteket közvetlen megfigyeléssel követjük fordított fázisú mikroszkóppal, és a nem tapadó sejtek különböző számaival, amint ez a citospin készítményen megfigyelhető az egyes táplálások után. Az összefolyás elérése előtt a tenyészeteket kollagenázzal kezeljük és enyhe ultrahangos kezelésnek vetjük alá mintegy 6-10 percen át A hematopoietikus sejteket és a sztrómális sejteket elkülönítjük sűrűség-gradiens módszerekkel. A hematopoietikus sejteket megszámoljuk hemacitometert alkalmazva, és ezek mintegy 50%-át fagyasztva tartósítjuk a korábban leírt módszert alkalmazva. A hematopoietikus sejtek fennmaradó 50%-át alikvotokra osztjuk, amelyek mintegy 106 sejtet tartalmaznak, és ezeket összefüggő sztrómális sejttenyészetekre inokuláljuk, amelyeket párhuzamosan növesztettünk. Amikor ezek kezdik elérni az összefolyást, ugyanezt az eljárást hajtjuk végre. Ez a technika: 1. a hematopoietikus sejtek növesztésének állandósítása olyan mikrokömyezetet biztosítva, amely a kívánt növekedési faktorokat termeli, és 2. egy folyamatos tárolóhely („bank”) képzése, ahol a hematopoietikus progenitorokat tárolni lehet, amíg az átültetéshez alkalmas számot elérjük. A hematopoietikus sejtnövekedés módosítása sejttermékekkel. A jelenleg létező technológia a humán csontvelő különböző sejtkomponenseinek altenyésztése elkülönült tenyészetekként Makrofágokat, retikuláris sejteket, adipocitákat és fibroblasztokat lehet külön-külön növeszteni, és kiválasztó aktivitásukat különböző szerekkel végzett kezeléssel módosítani. A fibroblaszt aktivitás módosítását már korábban leírták. A hematopoiézist a hosszú időtartamú humán csontvelőtenyészetekben, három dimenziós hálózaton szintén lehet módosítani velősejten kívüli (extramedulláris) makrofágok (Kupffer-scjtek) kiválasztásával, amikor a tenyészetben az alábbi módon növesztünk. Kupffer-sejteket különítünk el szervi sztrómájálól pronázos emésztés után. Röviden, a szöveti mintákat 1 órán át inkubáljuk pronáz oldatban [0,2% pronáz (Calbiochem) és Geyféle kiegyensúlyozott sóoldat (B55)], miközben óvatosan keverjük. Az oldat pH-ját 7,3 és 7,5 között tartjuk In 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
