202578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csontvelősejtek replikálására három dimenziós sejttenyésztő rendszerben, három dimenziós támasztó anyag a rendszerhez, és eljárás citotoxicitás vizsgálatára ezen rendszer segítségével
9 HU 202 578 B 10 NaOH-val. Dezoxiribonukleázt (0,5 mg) (Calbiochem) adunk hozzá 30 perces időközönként a fenti eljárás során, és az így létrejött sejtszuszpenziót szűrjük és centrifugáljuk 350 g-nél 10 percen át. Az üledéket újra szuszpendáljuk Gey-féle B55-ben, és a littorális sejteket (makrofágok és hámsejtek) elkülönítjük a celluláris törmeléktől és érett vérsejtektől, Percoll (Pharmacia) gradienst alkalmazva. Az így létrejött sejtfrakciót 3x3 percig mossuk 10% borjúembrió szérummal dúsított, módosított Dulbecco tápközeggel, és műanyag tenyésztő edényekre helyezzük olyan térfogatban, hogy 3-4 x 106 sejtet tartalmazzon. 1 napos inkubálás után a nem tapadó sejteket eltávolítjuk tenyésztő tápközeggel végzett mosással, és a tapadó sejteket 30 ”C hőmérsékleten fenntartjuk olyan gázkeverékben, amely 6% CO^-t tartalmaz szobalevegőben, 80% fölötti relatív nedvességtartalomnál. Ezeknek a sejteknek a növesztését és/vagy kiválasztási aktivitását az alábbiak szerint stimulálhatjuk: 1. A C02: 02 arány változtatása; 2. A tenyészetek kezelése látex gyöngyökkel; 3. A tenyészetek kezelése kovafölddel; 4. prosztaglandin E2, E, vagy F2a hozzáadása a tápközeghez; 5. A tápközeg kiegészítése interleukin 1-gyel vagy interleukin 2-vel. A makrofág kiválasztási termékeket is lehet módosítani ezekkel az eljárásokkal/szerekkel. Ezeknek a makrofágoknak a kiválasztási termékeivel kondicionált tápközeget alkalmazhatjuk, hogy kiegészíthessük a hosszú időtartamú csontvelőtenyészet eritropoietikus/granulopoietikus arányát lényegében azonos módon, ahogyan ez in vivo történik. A jelen találmány szerinti eljárás számos előnnyel bír azok számára a betegek számára, akiknek csontvelő-átültetésre van szükségük. In vitro csontvelő replikációs rendszer alkalmazása egy beteg állapotának követésére Rákos vagy más betegségben szenvedő betegben gyakran hatásos a beteg állapotának követése egy rész leszívásával a beteg csontvelőjéből, és a minta megvizsgálásával. Ezen a módon az áttétel vagy a visszaesés kimutatható, mielőtt az klinikailag nyilvánvaló lenne. Azok a betegek, akik más olyan állapotoknak lehetnek kitéve, amelyek a csontvelő vizsgálatával követhetők, szintén megfigyelhetők ezen az úton. A hosszú időtartamú növekedés egy leszívott csontvelőmintában a jelen találmány szerinti csontvelő replikációs rendszert alkalmazva, növeli a kromoszomális rendellenességekkel bíró áttételes sejtek és hematopoietikus sejtek kimutatásának valószínűségét. Ezek a sejtek elkerülhetik a kimutatást a frissen leszívott (nem tenyésztett) csontvelő hagyományos kenetéiben. Az in vitro csontvelő replikációs rendszer alkalmazása citotoxicitás vizsgálatára A gyógyszerek, neoplazma elleni szerek, karcinogének, élelmiszer-adalékok és más anyagok citotoxicitását csontvelőre megvizsgálhatjuk a jelen találmány szerinti in vitro csontvelő replikációs rendszert alkalmazva. Először csontvelősejtek (beleértve mind a sztrómális, mind a hematopoietikus sejteket) stabil, növekvő tenyészeteit hozzuk létre. Ezután a tenyészeteket a vizsgált szer különböző koncentrációinak tesszük ki. A vizsgáló szerekkel végzett inkubálás után a tenyészetet fázismikroszkóppal megvizsgáljuk, hogy meghatározzuk a legnagyobb eltűrt dózist (HTD), vagyis a vizsgált szernek azt a koncentrációját, amelynél a legkorábbi morfológiai rendellenességek feltűnnek. A citotoxicitási vizsgálatot különböző életképesség-vizsgáló festékeket alkalmazva hajthatjuk végre, hogy megállapítsuk a sejt életképességét ebben a három dimenziós rendszerben, olyan technikákat alkalmazva, amely jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak. A HTD-meghatározás koncentrációtartományt nyújt a további vizsgálatokhoz. Amikor a vizsgálati tartományt meghatároztuk, a vizsgált szer különböző koncentrációit vizsgálhatjuk mege a csontvelőtenyészetet alkotó különböző sejttípusok életképességére, növekedésére és/vagy morfológiájára, olyan módszerekkel, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Más három dimenziós sejttenyésztő rendszerek, amelyeket a jelen találmányban ismertetünk, szintén adoptálhatok a citotoxicitási vizsgálatban való felhasználáshoz. Eljárás egy három dimenziós sejttenyésztő rendszer létrehozására A jelen találmány ismertet egy három dimenziós támasztóanyagot és ismerteti ennek alkalmazását keretként egy három dimenziós, többrétegű sejttenyésztő rendszerben. A korábban ismert szövettenyésztő rendszerekben a sejteket egy rétegben növesztették. Egy három dimenziós támasztóanyagon a jelen találmány szerint növekvő sejtek több rétegben növekednek, celluláris mátrixot képezve. Ez a három dimenziós sejttenyésztő rendszer nagyobb mértékben közelíti meg az in vivo talált fiziológiai körülményeket, mint az eddig leírt egyrétegű szövettenyésztő rendszerek. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában e három dimenziós sejttenyésztő rendszert át lehet vinni élő organizmusra vagy organizmusba. A három dimenziós támasztóanyag lehet az olyan anyagok bármelyike, amely a) lehetővé teszi, hogy a sejtek kötődjenek hozzá (vagy úgy lehet módosítani, hogy lehetővé váljék, hogy a sejtek kötődjenek hozzá) és b) lehetővé teszi, hogy a sejtek több, mint egy rétegben nőjenek. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában a támasztóanyag egy háló, amely 200 -600 pm2 szitaterülettel és 50-200 pm rostátmérővel rendelkezik. Arra a következtetésre juthatunk, hogy a három dimenziós sejttenyésztő rendszer alkalmazható csontvelő, bőr, máj és más típusú sejtekhez és szövetekhez. így pl. egy három dimenziós bőr sejttenyészetet az alábbiak szerint készítünk el: 1. Lehetővé tesszük, hogy a fibroblasztok kötődjenek egy hálóhoz, és ezt növesztjük 7-9 napon át, így helyezve el I és III típusú kollagént, amint ezt korábban már leírtuk az in vitro csontvelő replikációs rendszerekben alkalmazott, növekedést fokozó fíbroblasztoknál. 2. Melanocitákat viszünk fel a kezelt hálóra és hagyjuk növekedni 5 napon át 3. Keratinocitákat inokulálunk az összefolyó melanocitákra. Bár a jelen találmányt speciális kiviteli módjaival összefüggésben ismertettük, meg lehet érteni, hogy változásokat lehet végrehajtani anélkül, hogy eltérnénk a találmány oltalmi körétől, amelyet a fenti leírás és az alábbi igénypontok határolnak be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
