202578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csontvelősejtek replikálására három dimenziós sejttenyésztő rendszerben, három dimenziós támasztó anyag a rendszerhez, és eljárás citotoxicitás vizsgálatára ezen rendszer segítségével
5 HU 202 578 B 6 matosan keletkezni ugyanabban a tenyésztő rendszerben, azokat a rendszereket alkalmazva, amelyeket a jelen találmány kitanítása tartalmaz. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módja szerint a hematopoietikus sejtek növesztését az alábbiak szerint végezzük. 1. A sztrómális támasztóréteg létrehozása Csontvelő szuszpenziót centrifugálunk 34000 g-nél 20 percen át és a sejtek fehér üledékét, amely makrofágokat, fibroblasztokat, adipocitákat, monom ukleáris vérsejteket, retikuláris sejteket, hámsejteket és más benne lévő sejteket tartalmaz, eltávolítjuk. A sejteket Roswell Park Memorial Institute 1640-nek, egyszerűen csak „RPMI 1640”-nek nevezett tápközegben szuszpendáljuk. Az RPMI 1640 a GIBCO Incorporated of Grand Island-nál szerezhető be (New York, USA). Az RPMI 1640 10% borjúembrió szérummal, 10% lószérummal, hidrokortizon-hemiszukcináttal és megfelelő antibiotikumokkal van kiegészítve. Ezekből a sejtekből 106 sejtet steril nylonhálóra viszünk rá (ez a Tetko Corp. of New York terméke (New York, USA) petricsészében. Ezt a hálót úgy vágjuk ki, hogy illeszkedjék a 25 mm2-es műanyag tenyésztőlombik belső méreteihez. A hálószita területe 400 pm2 és a rostátmérő 100 pm. Az inokulált hálót azután feltekercseljük és a tenyésztőlombikba helyezzük, amely 5 ml, korábban leírt tápközeget tartalmaz. A háló kitekeredik a tenyésztőlombik belsejében és teljesen befedi a lombik fenekét. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten növesztjük 5% C02-t tartalmazó környezeti levegőben 90% fölötti relatív nedvességtartalommal. A sztrómális sejtek, amelyek zömmel fíbroblasztok, nőnek először végig és teljesen körülveszik a nylon rostok mindegyikét, mielőtt elkezdenének nőni a háló nyílásaiba. A sztrómális sejtek összefolyása mértékének egybe kell vágnia azzal, amely az egyetlen ábrában látható, a hemotopoietikus sejtek inokulálása előtt. A szuszpendált sztrómális sejteket is lehet fagyasztva tartósítani (krioprezerválás) ugyanazt a technikát alkalmazva, amelyet előzőleg a csontvelősejtekre leírtunk. Az összefolyó sejtek krioprezerválásánál a hálón, a hálót össze kell göngyölni és behelyezni az RPMI 1640 tápközeget tartalmazó Nunc csőbe, ahol ezeken kívül fagyasztási védőanyagként dimetil-szulfoxid és glicerin is van 5%, illetve 15% végső koncentrációban. A sztrómális sejtek fagyasztását a hálón -1 °C/perc kiindulási hűtési sebességgel hajthatjuk végre +1 °C-tól -40 °C-ig. A -2 —3 °C/perc optimális hűtési sebességet ezután addig alkalmazzuk, amíg a -84 'C végső stádiumának megfelelő hőmérsékletet elérjük. A sztrómális sejtek mintegy 20-25%-a leválik a nylonhálóról. 2. Inolculálás hematopoietikus sejtekkel Csontvelősejteket szuszpendálunk módosított Fischer-féle, vagy McCoy-féle 5A tápközegben, amely ki van egészítve 5-10% boíjúembrió szérummal, 5-10% lószérummal, vitaminokkal, hidrokortizonnal, glutaminnal és antibiotikumokkal. Ezek a sejtek lehetnek frissek, vagy eredhetnek korábban fagyasztással tartósított mintából, amelyet gyorsan engedtettünk fel 80 °C hőmérsékletű forró vízfürdőben. 2-5 x 106 sejtet inokulálunk összefolyó sztrómális sejthálózatra 25 mm2-es műanyag tenyésztőlombikban, és 33-34 °C hőmérsékleten növesztjük 5% C02-t tartalmazó környezeti levegőnél. Ezen tenyészetek relatív nedvességének nagyobbnak kell lennie, mint 90%. Három nap múlva a tenyészetek hőmérsékletét felemeljük 35 “C-ról 37 'C- ra. A hematopoietikus sejtek az összefolyó sztrómális sejtek által képzett természetes zsebekben nőnek, és a progenitor sejtek a sejtek tapadó rétegében maradnak. A tapadóréteget azok a sejtek képezik, amelyek közvetlenül a hálóhoz kötődnek vagy azok, amelyek közvetve kapcsolódnak olyan sejtekhez való kötődés révén, amelyek maguk közvetlenül kötődnek a hálóhoz. 4-5 nap múlva az érett granulociták, mononukleáris sejtek és eritrociták feltűnnek a nem tapadó rétegben, amint ez citospin készítéssel megfigyelhető. 7-10 nap múlva számos hematopoietikus réteg figyelhető meg a háló hézagaiban és ezek morfológiailag egybevágnak a CFU-C- vel, kevert telepekkel és limfoid telepekkel. A megakariocitás telepek növekedése korlátozott, de azért megfigyelhető ebben a mátrixban. Egy átlagos tenyészet 450- 950 CFU-C-t termel hetenként. A tenyészeteket, amelyek ugyanabból a személyből származó (autológ) sztrómális sejteket és hematopoietikus sejteket tartalmaznak, kétszer kell táplálni hetenként. Azokat a tenyészeteket, amelyek egy olyan beteg csontvelőjét tartalmazzák, amely egy másik egyénből származó (allogén) sztrómális sejthálózatba van inokulálva, hetenként háromszor kell táplálni, hogy biztosítsuk az érett, immunkompetens sejtek egyenértékű újratenyésztődését a nem tapadó rétegből. 3. Eljárás az in vitro csontvelő replikációs rendszerben a csontvelő sztrómális sejtek növekedésének fokozására A csontvelő sztrómális sejtek növekedésében az elsődleges sebességcsökkentő faktor a fíbroblasztok viszonylag kicsiny mitotikus indexe (ahol a fíbroblasztok a csontvelő sztrómális sejtekhez tartoznak). Ezeknek a sejteknek a növekedését és elhelyezkedésüket az extracelluláris-mátrix komponensek között fokozni lehet az alábbiak hozzáadásával: 1. hidrokortizon-hemiszukcinát és/vagy 2. önszabályozó növekedési faktorok, amelyek a tenyésztett humán embrió fibroblaszt tápközegéből származnak, amely fíbroblasztok a sejtosztódás nagy sebességével rendelkeznek. A fíbroblasztok kötődése és növekedése a hálón növelhető még a következőkkel: 1. a háló előburkolásával szolubilizált típusú I-IV kollagénnel, vagy 2. olyan hálót alkalmazva, amely emberi embrió fibroblaszt vagy felnőtt fibroblaszt (ezeket azután együttesen „növekedést fokozó fibroblaszt”-nak nevezzük) által kiválasztott kollagénnel van burkolva vagy beágyazva, ahol a fenti fíbroblasztok azon képességük alapján lettek kiszelektálva, hogy bizonyos kollagén típusokat szintetizálnak. Ebből a szempontból a növekedést fokozó fibroblasztokat enyhe tripszinezéssel szedjük le a hálóról, mielőtt elérné az összefolyást (5-7 nap az emberi embrió fibroblasztoknál, illetve 14-18 nap a felnőtt fibroblasztoknál); és vagy 1. inokulálhatjuk sztrómális csontvelősejtekkel, amint ezt korábban leírtuk, vagy 2. fagyasztással tartósíthatjuk a jövőbeni felhasználáshoz. A jelen találmány egyik kiviteli módjában a növekedést fokozó fibroblasztokat, amelyek kollagént szintetizálnak, és más extracelluláris mátrix komponenseket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
