202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
15 HU 202 577 B 16 ugyanennek az elektródnak a felhasználásával újabb 137 órán át folytatjuk, de a glukóz oldat utánpótlását egy nagy tartályból történő cirkuláltatással biztosítottuk oly módon, hogy 5 raM koncentrációt tartsunk fenn. A kitermelés egy 100 órás időtartam alatt lassan csökken, majd 45 pA értéken stabilizálódik; ez az érték további 40 órán át fennmarad. Lehetséges, hogy ezen időtartam alatt egy bizonyos mennyiségű, lazán kötött enzim vált le az elektród hordozóról (bár nem figyelhető meg az áramkitermelésnek a kevertetési sebességtől való függése), vagy valamilyen más tényező hatása érvényesült Az előbbiekben leírt hosszú időtartamú kísérletek elvégzése után a korábbiakban leírt módon vizsgáljuk az elektród válaszreakcióját, egy meghatározott glukóz koncentráció tartományban. Bár a szignál amplitúdója kisebb, mint a frissen összeállított berendezés esetében, az elektród nagyon kielégítő „lépcsős” működést mutat a 0-30 mM glukóz koncentráció tartományban. Ez arra mutat, hogy a terhelés alatt való hosszú használat eredményeként nem szenvedett semmiféle káros hatást Ezt a következtetést három további kísérletben erősítjük meg 1 heti (4 *C-on való), majd 8 heti tárolás után, illetőleg további 113 órán át ismét terhelés alatti üzemeltetéssel. A meghatározott glukóz koncentráció tartományra vonatkozó válaszreakciók változaüannak bizonyulnak. Ezek a vizsgálatok arra mutatnak, hogy egy elektród összesen legalább 250 órán (vagy több mint 15 000 percen át) működtethető, azaz az elektród anyag használhatósági időtartama becsülhetően rendkívül hosszú. A technika állása szerinti enzim elektródok üzemi élettartama rendszerint sokkal rövidebb, mint a találmány szerintieké: sok esetben csak néhány órát tesz ki: Turner, Proceedings Biotech 85 (Europe), Online Publications, Pinna1, Nagy-Britannia, 1985,181-192). A ferrocénhez kötött glukózoxidáz alapú glukóz elektródok felezési ideje pl. általában kb. 24 óra (Turner, idézeti hely), míg Cass et al. (Anal, Chem. 56,667-673,1984) ugyanerre az elektródra egy 50 órás, teljes stabilitásra mutató élettartamot ad meg. Ha egy (találmány szerinti) elektródot 50 egymásutáni mérés során 5 mM glukóz oldatban alkalmazunk, a standard eltérés 1%-nál kisebb. Alkalmasság a folyamatos követés szempontjából Az előbbiekben leírt újra felhasználási kísérletekben rögzített végső válasz-szint (45 pA 5 mM glukóz oldatban) változatlan marad levegőztetett oldatok alkalmazása esetén és több hetes további tárolás után is változatlan marad. Az erről az elektródról származó áramkitermelés stabilitását -12 óra alatt - ellenőrzött kísérleti körülmények közölt vizsgáljuk, sterilizált glukóz oldatok felhasználásával olyan körülmények között, amelyeket a bakteriális szennyezés hatására fellépő esetleges glukóz veszteség kiküszöbölése szempontja alapján alakítottunk ki. A jel a teljes időszak alatt állandó marad; ez arra mutat, hogy az elektród kiindulási „kondicionálása”, kcvertetett és cirkuláltatott oldatban, több nap alatt teljes eredménnyel jár. Ezek az elektródok - amelyeket az előbbi, vagy valamilyen más, megfelelő kondicionálási/mosási eljárással megfelelően kondicionálunk, ott találnak alkalmazásra, ahol a glukóz koncentráció folyamatos követésére van szükség. Az egyes sarzsok reprodukálhatósága Feltéve, hogy megfelelően „tiszta” előállítási körülményeket létesítünk, a találmány szerinti eljárással előállított minden elektród a leírt módon működik, és jó eredményeket ad a glukóz meghatározása során. Azonos méretű, azonos eljárással előállított elektródpárok közel azonos válaszokat szolgáltatnak (azonos körülmények között való kipróbálás során az áramerősség értéke néhány %-os eltérést mutat). Ezenkívül valamennyi ily módon előállított elektród élettartama nagyon hosszú és tartóssága, mint ezt az előbbiekben jeleztük, megbízható, szemben a technika állása szerinti glukóz elektródokéval. így a találmány szerinti elektródok megfelelően tárolhatók és több héten át használhatók, míg a technika állása szerinti elektródok gyakran nagy eltéréseket mutatnak ugyanazon a sarzson belül. Turner (idézett hely) megjegyzi, hogy pl. bár egy sarzson belül néhány glukózoxidáz elektród élettartama alkalomadtán kivételesen hosszú lehet (felezési idő600óra), a többség felezési ideje kb. 24 óra. Ezért az ilyen elektródok 24 óránál csak kevéssel hosszabb időtartamokon át használhatók biztonságosan. A válasz függése az oxigén koncentrációtól Az oldott oxigén hatásának vizsgálatára egy kísérleti cellát úgy módosítunk, hogy a glukóz elektródon kívül az egy oxigén elektródot is magába foglaljon. Kísérleteket végzünk amelyekben az oldott oxigént argonnal való átöblítéssel kiűzzük a rendszerből. Ilyen körülmények között az (előbbi) A típusú elektród glukóz hozzáadására gyors választ ad; ez arra mutat, hogy működési mechanizmusa nagymértékben független a környezeti oxigén koncentrációtól. Ez az eredmény az elektród felületi szerkezete és az enzim előnyös módon történt rögzítése kombinációjából származó konkrét jellemzőknek tulajdonítható és korábban nem volt megfigyelhető. Egy további kísérletben (4. ábra) követjük az A típusú (az előbbi A módszerrel előállított) elektród kimenő szignáljának folyamatos argon-öblítés közben -600 mV feszültségen - való alakulását. Egyidejűleg mérjük a minta oxigén nyomását. A 4. ábrán bemutatott eredmények lényegében állandó áramszignált jeleznek (felső diagram), amely lényegében független a mintaoldat oxigén nyomásától (alsó görbe). Egy másik kísérletben a szignál látszólag nem változik egy 10 perces időtartam alatt, míg az oxigénnyomás gyorsan csökken. Egy másik (a B eljárással előállított) elektród esetében megfigyelhető az áramerősség gyors csökkenése - 3 perc alatt 5% alá -, miközben az oxigén 90%-a eltávozott. Az áramerősség növekedése ugyancsak megfigyelhető, ha az oxigént visszavezetjük a rendszerbe, bár a növekedés viszonylag lassan megy végbe. Argonnal való hosszas öblítés során az elektród csak korlátozott glukóz koncentráció tartományra reagál és lehetséges, hogy oxigénnyomok jelenlétére van szükség az enzim funkció azon részének „gerjesztésére”, amely hidrogénnek a szubsztrátumból való eltávolításáért felelős. Az sem zárható ki, hogy az elektródon (alacsony koncentrációban és az oxigén elektród által nem kimutatható módon) oxigén adszorbeálódott és bizonyos mértékben ez is szerepet játszik az elektród viselkedésében. Enzim terhelés A glukózfogyás sebességére és a maximális áramsűrűségekre vonatkozó független mérések arra mutatnak, hogy az (A típusú) elektród által aktívan rögzített enzim mennyisége kb. 7 pg/cm2 elektród-felület mennyiségű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
