202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
17 HU 202 577 B 18 aktív enzimnek felel meg. (Az irodalomban kevés információ áll rendelkezésre a hasonló, glukózoxidáz alapú bioszenzorok enzimterhelésére vonatkozóan.) A rögzítési eljárás során azt találjuk, hogy nagyon aktív elektródok állíthatók eló még abban az esetben is, ha az enzimoldatot nagymértékben - pl. 10-szeresére - hígítjuk. A válasz hőmérsékletfüggése Az A típusú elektródokat a 0-30 mM glukóz koncentráció tartományban 10 és 37 *C közötti hőmérsékleten vizsgáljuk. A hőmérsékleti együttható 2-3% (fok) (kb. 24 kJ mól'1 Arrhenius-f. aktiválási energiának megfelelően). Ez összehasonlítható azzal 4%/"C értékkel, amelyet a ferrocénnel működő bioszenzorok esetében leírnak (Cass et al., 1. az idézett helyet). pH függés Megfigyelhető, hogy a válaszreakció kismértékben függ a pH-tól. pH 7,0 és 8,0 érték között azonban a válasz gyakorlatilag pH-függetlennek mutatkozik, eltekintve a nagyon magas (25 mM-nál nagyobb) glukózszintek esetétől. A védőmembránnal bevont elektród válaszreakciója Azt találtuk, hogy egy polikarbonát membrán kis változást okoz az elektród válaszreakciójában, kevertetett rendszerben. Nem kevertetett rendszerben a válasz időtartama kb. 20 másodperc. Az elektród teljes vérminták elemzésére való felhasználása A polikarbonáttal bevont elektródok megfelelően alkalmazhatók a glukóz vérben való közvetlen meghatározására. Az aszkorbinsav sók interferenciája 0,2 mmól/liter koncentrációban a teljes jel kb. 2,5%-át képezi, 5 mmól/liter glukóz koncentráció mellett Az elektród különböző elrendezésű analitikai bioszenzorokban való alkalmazása A találmány szerinti enzim elektród Rank-típusú cellákban, módosított Clark elektród alkalmazása mellett való sikeres felhasználását, amelyet az előbbiekben írtunk le, a fent tárgyalt eredmények igazolják. Ugyancsak kimutatható, hogy az elektród kiváló eredményeket ad más szenzor üzemmódokban, pl. minták meghatározása esetén. Kialakítottunk pl. egy sokféle, szokásos elektródban általánosan használt, 2 mm átmérőjű szondát, amelyben az elektródot egy huzalra szereltük fel és beforrasztottuk egy üvegcsőbe. Ez (referencia- és mérőelektródokkal kiegészítve) bemeríthető egy kevertetett vizsgálandó oldatba, amelyet főzőpohárba vagy más edénybe öntöttünk be. így megbízható méréseket végezhetünk a glukóz koncentráció meghatározására anélkül, hogy szükség lenne az atmoszférikus oxigén kiküszöbölésére. Ezzel és kisebb szondákkal való, hasonló kialakítás mellett végzett mérések alapján az állapítható meg, hogy az elektród áram formájában jelentkező válasza egy meghatározott glukóz koncentrációjú oldatban közel arányos az elektród virtuális felületével vagy súlyával. Szerkesztettünk olyan szondákat is, amelyekben az elektród méretei minimálisak (kb. 0,25-0,50 mm2 felület, 30-60 |ig tömeg). A szálra szerelt elektródot műanyag hüvellyel vonjuk be és a hüvellyel ellátott szondát behelyezzük egy katéter tűbe (1,5 mm átmérő). A tű egy gumidugón keresztül bevezethető egy edénybe (amely egy fermentor vagy hasonló berendezés vagy egy nagy tartály részét képezheti) és szenzor szondaként alkalmazható az edényben található oldat glukóz koncentrációjának mérésére. Ebben az elrendezésben az érzékelő elektródot a bemerítés idején védi az azt körülvevő tű, de szükség esetén a beviteli fázist követően a tű el is távolítható. Míg az előbbiekben leírt miniatűr szondák jellegzetesen az 1-10 (lA tartományba eső jeleket adnak, megfelelő műszerezéssel biztosítható, hogy pontos méréseket végezhessünk az 1-100 nA tartományban. Mivel ebben a tartományban az áramjeleket (a találmány szerinti) nagyon kis méretű (kb. 0,005 mm2 felületű, 1 pg tömegű) enzimelektródok szolgáltatják, ezek az elektródok beépíthetők olyan finom tűs mikroszondákba, amelyek az in vivo mérésekhez használt katéterekben kerülnek felhasználásra. Bár a találmány szerinti elektródok működési alapmechanizmusa nem teljesen tisztázott, a kapott eredmények alapján levonhatunk bizonyos következtetéseket, így ismeretes, hogy aktív felületi csoportok jelenléte a szénen - ezek magas hőmérsékleteken végzett felületi oxidációval alakíthatók ki - hajlamossá teszi a felületet keresztkötéses reakcióba lépésre (ilyen reakciók szükségesek az enzimek rögzítéséhez), és az ilyen felületi csoportok száma és köre valószínűleg növelhető, ha vékonyréteg-felületi katalizátorként platina (vagy más, platina csoportbeli fém) van jelen (Kinoshita-Stonchart, Modem Aspects of Electrochemistry, No. 12, kiadó Bockris és Conway, Plenum Press, New York, 183-266, 1977). Nyilvánvaló, hogy különböző rögzítési módok esetén az enzimek kötődése különböző lehet. Számos leírt eljárás szerint pl. különböző aminosav maradékokat alkalmaznak az enzim rögzítésére, míg a cianursavkloridos aktiválású anyagokkal kötött enzimek esetében a kapcsolódás kizárólag a lizin maradékon keresztül jön létre (Ianielloés Yacynych, Anal. Chem. 53,2090-2095, 1981). Az enzimek tercier szerkezetében a rögzítés következtében végbement változások várhatóan nem azonosak minden rögzítési eljárás esetében. Ezzel magyarázható, hogy az ilyen típusú munka során nagy változatosság figyelhető meg az enzim aktivitásban és stabilitásban. A találmány szerint alkalmazott alapelektród rendkívül heterogén jellege - szemben az olyan típusú elektródokkal, amelyeket réteges, nem heterogén szerkezet jellemez (ilyeneket ír le pl. az 56-163 447 sz. közzétett japán bejelentés) - maximálissá teszi annak a valószínűségét, hogy egy integrált háromdimenziós szerkezetben számos, különböző típusú és orientációjú keresztkötés alakuljon ki. Keresztkötöző reagensek távollétében ez szintén erős felületi adszorpciót eredményez. A kötött szénmátrixban jelenlevő pórusok lehetővé teszik, hogy az enzimmolekulák bejussanak a mátrix komponenseibe és körülvegyék ezeket; ez igen nagy felületet biztosít az enzimnek és olyan konformációk kialakulását teszi lehetővé, amelyek az enzim stabilitása és aktivitása szempontjából kedvezők. (Ez ellentétes a sokkal kisebb felületű, aránylag sík felületekre - amilyen a platina, az „üveges” szén vagy a grafit - való kötődés esetével, amelyben konformációs feszültségek lépnek fel, amint ezt korábbi irodalmi adatok jelzik). Ezenkívül a találmány szerinti elektródok rendkívül alacsony reak5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
