202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
13 HU 202 577 B 14 beállított munkaelektródokkal végezzük és a keletkezett áramot egy 0,14 cm2 névleges felületű, a szubsztrát oldatnak kitett elektróddal mérjük. Az ábrákon az eredményeket áramsűrűség dimenzióban (a szubsztrát oldatnak kitett (a) elektród egységnyi felületére számított áramkitermelésként) fejezzük ki. A 16. ábrán látható, hogy a (B) platina érintkezést a (Q referencia/mérő elektród veszi körül, tóle egy (G) szigeteld hüvellyel elválasztva. Egy „O” gyűrűre szerelt porózus polikarbonát membránt használunk fel arra, hogy az (E) vizsgálati korongot (a rögzített enzimet tartalmazó papírelektród anyagból) a platina csatlakozón rögzítse. Az (F) nyitott mintakamra lehetővé teszi, hogy a minta csepegtetéssel legyen a membránra felvihető. Az elektródot tartalmazó cellát 325 mV feszültségre állítjuk be és az áramot az (A) potenciosztát segítségével mérjük. A kételektródos, 325 mV-ra beállított cella alkalmazása előnyösebb, mint a szokásos 3 elektródos, 600 mV-ra beállított celláé, nevezetesen használata egyszerűbb és a háttéráram alacsonyabb. Egyik rendszernek a másikkal szemben való előnyben részesítése azonban nem befolyásolja lényegesen a találmány szerinti elektródok teljesítmény jellemzőit, amilyen a tárolási stabilitás, stabilitás a használat során, a válasz vagy az oxigénkoncentrációtól való függés linearitása. A kapott eredményeket részletesebben a következőkben tárgyaljuk meg. A válaszok linearitása és időfüggése Az 1. ábrán jellegzetes példákat mutatunk be az elektródválaszra, amely fokozatos glukózadagolás esetén - a 0-35 mM végkoncentráció tartományban - megfigyelhető, 3 elektródás cella és kevertetés alkalmazása mellett. Mindhárom elektród - A, B és C - glukózoxidázt tartalmaz, amelyet az előbbi A. eljárással vittünk fel. Az A elektród egy találmány szerinti aktivált, platinával bevont szénhordozóból áll, azaz egy gyantával (politetrafluoretilén) megkötött, platinával bevont szénporból öntött lap. A B elektród egy elektromosan vezető test, amelyet egy grafitrúd metszetéből vágtunk ki; a C elektród egy elektromosan vezető hordozó, amelyet egy, a kereskedelemben hozzáférhető, platinát nem tartalmazó karbonpapírból vágtunk ki. Mint látható, a B és a C elektród kisebb, viszonylag elnyújtott válaszokat ad, amelyek az irodalomban általában a mediátoros szenzorokkal kapott bemutatott eredményekre emlékeztetnek. Az A elektród megbízhatóbb és állandó válaszokat ad és a válasz ideje kb. 1 másodperc. (A kezdeti válasz csúcsán megfigyelhető jelben a „hegy” részben jelentéktelen melléktermék, amely az injektálási módszerrel függ össze; az érdeklődésre számot tartó jel a glukóz koncentrációtól függő plató.) Mindhárom elektród lényegében lineáris választ ad a glukóz koncentráció függvényében (a 2. ábrán csak az A és a C elektródra vonatkozó eredményeket mutatjuk be). E koncentrációtartomány átfogja azt a közt, amely a glukóz vérben való közvetlen meghatározásához szükséges (0-30 mM). Hasonló eredményeket kapunk A típusú elektródokkal, ha az előbbi B rögzítési eljárást alkalmazzuk. Ez arra mutat, hogy az eljárás nagyobb tartomány esetében még jobb linearitással jellemezhető. Mint a 2. ábrán ezt bemutatjuk, az A elektród válasza 23 nap múlva látszólag változatlan, a többi elektródé azonban (amint ezt a C elektródra vonatkozóan bemutatjuk) az időben romlik. Ilyen típusú viselkedést figyeltünk meg az előbbiekben leírt többi rögzítési mód esetében is. Mindegyik ilyen eljárás alkalmazható volt megfelelő válasz adására képes és stabil elektród előállítására az A elektród esetében alkalmazott szén anyagból, de nem megfelelő elektródokat szolgáltatott számos más inaktív szénanyag esetében. Az A elektród reakcióideje tehát 23 nap elteltével változatlannak bizonyul, míg más elektródok megnövekedett reakcióidőket mutatnak. A kiindulási válasz ideje kb. 23-30 másodperc; ez 8 nap múlva 2-3 percre nő. Az aktív elektródok (pl. az A elektród) esetében általában egy bizonyos csökkenés figyelhető meg a reakcióidőben az első nap során, de ekkor a reakcióidő az idő tekintetében egy platót ér el. A nedvesen (pH 5,6) 4 *C-on tárolt és egy 6 hónapos periódus alatt időközönként vizsgált A típusú elektródok (az első néhány nap után) csak kismértékű változást mutattak és bár ezen időtartam után egy bizonyos fokozatos romlás volt megfigyelhető, 12 hónap után a válasz még mindig az eredeti érték 70%-a volt Az 1. és 2. ábra az elektród áram kitermelését mutatja be - |xA. cnr2 dimenzióban - 600 mV üzemi feszültség mellett, a 15. ábrán bemutatott 3 elektródoskonfiguráció alkalmazása esetén. A találmány szerinti elektródok megnövekedett tárolási idejét és stabilitását szemlélteti az 5. ábra is, amely a karbodiimiddel rögzített glukózoxidáz elektród 5 mmól glukózra adott válaszát mutatja be pH 5,6 acetát pufferben szobahőmérsékleten 180 napon át való tárolás után. A technika állása szerinti elektródra (1. példa) vonatkozó összehasonlító eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Az 5. ábrának megfelelő méréseket 600 mV- on végezzük a 3 elektródos rendszerrel, a 6. ábra szerintieket pedig 325 mV-on, a 2 elektródos konfigurációval. A technika állása szerinü elektródokkal (1. példa) és a találmány szerinti elektródokkal - különböző enzimek és különböző rögzítési eljárások alkalmazásával - kapott válaszgörbék további összehasonlítását a 7-9. ábrán mutatjuk be. Valamennyi mérést 325 mV-on végezzük. A laktátra, galaktózra és laktózra (kombinált glukózoxidáz és beta-galaktozidáz) vonatkozó válaszgörbéket a 10-12. ábrán szemléltetjük. Ezeket a méréseket 600 mV-on végezzük. Az elektród újra felhasználása: az ismételt mérésekre való alkalmasság Folyamatos terhelés során a találmány szerinti elektródok kivételes tartósságot mutatnak; ez az élettartam korábban nem volt megfigyelhető. Az előbbi állítást a következő, extrém szigorúságú lépésekből álló reakciósorral igazoljuk. Először egy glukózoxidáz elektródot (2. példa) elhelyezünk egy zárt cellában és hagyjuk amperometriásan reagálni egy kevertetett glukóz oldattal (kiindulási koncentráció 5 mM, kiindulási áramerősség 100 |iA). A rendszert 18 órán át folytonosan működtetjük; ezen idő alatt a jel értéke fokozatosan 10 |xA alá csökken. A képződött teljes elektromosság az elméletileg várt érték kb. 75%-ának felel meg (azon az alapon számítva, hogy 1 molekula glukóz 2 elektront ad le). Ezt a kísérletet ugyanezzel az elektróddal azonnal megismételjük a glukóz oldat kicserélése mellett. Ennek során az eredeti áram viszonyok állnak újra be, és a szubsztrát folyamatos terhelés alatt való „kimerülése” azonos eredményeket ad. Egy következő kísérletben az áramszolgáltatást 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
