202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
11 HU 202 577 B 12 hogy kolloid platinát (részecskenagyság 1,5-2,5 nm) választunk le a szénpor (névleges részecskenagyság 30 nm) felületére, komplex platinaszulfitsav (II) H202 felhasználásával történő oxidativ elbontásával. Ezt követően kb. 50 tömeg% politetrafluoretilén alkalmazásával a platinával bevont szénport öntéssel és ragasztással felvisszük egy, a kereskedelemben kapható grafitos karbonpapír felületére. A végtermék platinaterhelése 0,24 mg.cnr2. APrototech anyag különböző mintáin glukózoxidázt rögzítünk az előzőkben leírt kezelések valamelyikével, mint karbodiimides, karbonil-diimidazolos és DFDNB- vel végzett kezeléssel. Külön kísérletekben glukózoxidázt rögzítünk a Prototech anyagon glutáraldehides keresztkötéssel és egyszerű adszorpcióval, azaz keresztkötések kialakítása nélkül. Ez utóbbi esetben úgy járunk el, hogy a Prototech anyagot pH 5,6 acetát pufferrel frissen készített glukózoxidáz oldatban (5,0 mg.ml-1) szuszpendáljuk és 90 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Egy másik megoldás szerint az enzim adszorpciója célszerűen elektroforézis segítségével hajtható végre. Ebből a célból az elektród alapanyagot pozitív feszültség mellett 60 percen át szuszpendáljuk az enzim oldatban. 3. példa Az előzőkben leírt karbodiimides kezelést alkalmazva a következő enzimeket rögzítjük a Prototechtől származó platinatartalmú karbonpapírokon, ill. egy PTFE- kötésű karbonpapíron, amelyet a 4 044 193 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint platinával előkezelt szénporból állítottuk elő: laktát-oxidáz gálák tóz-oxidáz glukózoxidáz/beta-galaktoxidáz. A találmány szerinti eljárás előnyeinek és a találmány szerinti enzimelektród anyagok tulajdonságainak szemléltetésére, a technika állása szerinti elektródokkal való összehasonlítás céljából, az előző példák szerint előállított enzimelektród anyagokat megvizsgáljuk az amperometriás válasz szempontjából. Ezt a vizsgálatot egy módosított Rank oxigén elektród rendszert (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge) tartalmazó cellában hajtjuk végre, amelyet a rajzokon mutatunk be, és amelynek leírása az Anal. Chim. Acta 183, 59-66 (1986) helyen található meg. Ebben a rendszerben a membránt egy (5 mm átmérőjű) karbonpapír enzimelektród helyettesíti, amelyet a találmány szerint állítottuk elő; ezt a platinagomb-elektród hordozza. A mérőelektródot (platinafó- Űa) a cella fedőlapján keresztül merítjük be. A referenciaelektród egy ezüst/ezüstklorid elektród. Egyes vizsgálatokban (védőmembrán jelenlétében és nem kevertetett ólatokban) kételektródos elrendezést alkalmazunk: a mérő/vonatkozási elektródot egy kloriddal bevont ezüstgyűrű képezi. A pH 7,0 pufferrel elkészített vizsgálandó oldatokat rendszerint mágneses keverővei kevertetjük, míg a munkaelektródot a vonatkozási elektródhoz képest 600 mV feszültségen tartjuk, egy potenciaosztat segítségével. Ha a kételektródos elrendezést alkalmazzuk, 325 m V feszültséget állítunk be. Megfelelő ideig várunk annak érdekében, hogy a háttéráram alacsony értékre álljon be, majd fecskendővel bevisszük a szubsztrát oldatot A válaszreakcióban keletkezett áramot diagram regisztráló berendezéssel rögzítjük. A kapott eredményeket részletesen az alábbiakban beszéljük meg, és grafikusan a rajzokon mutatjuk be, amelyek közül az a) 1. ábra a találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszreakcióját tünteti fel más típusú szénelektródokon rögzített glukózoxidázzal összehasonlítva; 2. ábra egy első diagram, amely a glukózoxidáz elektród stabilitását tünteti fel; 3. ábra egy második diagram, amely a glukózoxidáz elektród egy adott glukóz-koncentráció tartományban mériiető reakcióját szemlélteti; 4. ábra egy olyan diagram, amely a glukózoxidáz elektród változó környezeti oxigénnyomás körülményei között észlelhető reakcióját ábrázolja; 5. ábra egy diagram, amely a glukózoxidáz elektród szobahőmérsékleten való tárolása eredményét mutatja be; 6. ábra egy összehasonlító diagram, amely azt mutatja be, hogy a szobahőmérsékleten való tárolás hogyan befolyásolja a technika állása szerinti elektródot; 7. ábra összehasonlítást mutat be egy, a találmány szerinti, glutáraldehiddel rögzített glukózoxidáz elektród és egy, a technika állása szerinti, glutáraldehiddel rögzített glukózoxidáz elektród válasza között; 8. ábra a 7. ábrának felel meg, de a rögzítés karbodiimiddel történik; 9. ábra összehasonlítást mutat be egy, a találmány szerint karbodiimiddel rögzített laktát-oxidáz elektród és egy, a technika állása szerinti, karbodiimiddel rögzített laktát-oxidáz elektród válaszreakciója között; 10., ill. 11. ábra a találmány szerinti galaktóz-oxidáz és laktát-oxidáz elektród válaszprofilját szemlélteti és a 12. ábrán egy találmány szerinti kombinált glukózoxidáz/beta-galaktozidáz elektród válaszprofilja látható. A 13. ábrán egy találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszgörbéjét mutatjuk be, amelynek előállításakor politetrafluoretilén helyett a platinával bevont szénport kötőanyagaként polivinilacetátotalkalmazunk. A14. ábra egy találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszgörbéjét szemlélteti; ebben az esetben a glukózoxidázt olyan karbonpapír elektródon rögzítjük, amelynek felületi rétegét (politetrafluoretilén) gyantával kötött, palládium bevonatú szénpor alkotja. A 15. ábra a módosított Rank-f. elektrokémiai cellát ábrázolja, amelyet a találmány szerinti elektródok működési jellemzői meghatározására használtunk fel. A16. ábra a kételektródos konfigurációt szemlélteti, amelyet egyes mérések esetében alkalmaztunk. Mindenekelőtt a 15. ábra kapcsán megjegyezzük, hogy az itt közölt adatok zömét a 15. ábrán bemutatott elektrokémiai cella felhasználásával kaptuk. Ez egy kétrészes cella, amely az (1) alappal és a (2) gyűrűs köpenynyel rendelkezik; ez a (h) vízkamrát fogja össze, amelyen keresztül víz ciikuláltathaló, a cella hőmérsékletének ellenőrzésére. A két részt a (3) rögzített menetes karmantyú köti össze. Az (1) alapban középen helyeztük el a (d) platina érintkezőt, amelyre a rögzített enzimet hordozó papírelektród anyagból kivágott (a) korongot helyezzük. Ezt az (e) és (f) O-gumigyűrű-tömítés rögzíti a platina érintkezőn, a cella két részének összekapcsolásakor. A cella természetesen tartalmazza a szubsztrát oldatot. Tetejébe illesztve helyezkedik el a (g) állítható csatlakozó által hordozott (4) dugasz; ebbe szereljük be a (b) platina mérőelektródot és a (c) Ag/AgCl vonatkozási elektródot. Mint említettük, a vizsgálatokat 600 mV-ra 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
