202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
9 HU 202 577 B 10 vélik a szenzor válaszreakciójának időtartamát. Ennek ellenére, még ilyen membránok alkalmazása esetén is a találmány szerinti szenzorok képesek olyan reakcióidők biztosítására, amelyek összehasonlíthatók - és sok esetben lényegesen jobbak - a szokásos enzimelektródokkal elérhetőkkel (elérhetőknél). Mint már említettük, a találmány tárgyát közelebbről glukózoxidáz elektródok képezik, azaz olyan elektródok, amelyekben a rögzített enzim glukózoxidáz. A következőkben azonban kimutatjuk, hogy más oxidoreduktázok is alkalmazhatók, bár nem mindig ugyanolyan hatásfokkal. Ez nem szükségszerűen az enzim termel szetes hatástalanságával függ össze, hanem más tényezőkre vezethető vissza. Az oxálsav oxalát-oxidáz alkalmazásával végzett meghatározása során pl. maga az oxálsav szubsztrátum elektrokémiai oxidáción megy át az alapelektródon, és ez nagymértékben elfedi az enzim hatását Megfelelő oxidoreduktáznak tekinthető azonban több más enzim, pl. a laktát-oxidáz, galaktóz-oxidáz, koleszterin-oxidáz és más, peroxidot termelő enzimek, valamint rögzített enzimek kombinációi, ideértve egy nem oxidáz és egy oxidáz típusú enzim kombinációját (ezek közül az első a számunkra érdekes szubsztrátra hat és oxidálható szubsztrátumot képez az oxidáz számára, míg az utóbbi az oxidálható termékkel reagál és eközben mérhető áramerősség észlelhető, amely arányos a számunkra érdekes szubsztrát koncentrációjával). Ilyen kombináció pl. a beta-galaktozidáz és a glukózoxidáz keveréke (a laktóz kvantitatív meghatározására) vagy a beta-glukán-depolimeráz, a beta-glukozidáz és a glukózoxidáz keveréke (a beta-glukánok meghatározására). A szenzor más típusú alkalmazásai közé tartozik olyan enzimes vagy nem enzimes reagensek vagy eljárások alkalmazása, amelyek egy prekurzor reakcióban reagálnak egy számunkra érdekes primer szubsztráttal és a kapott termék olyan anyagot tartalmaz, amely viszont szubsztrátként hat a találmány szerinti enzimelektród szempontjából. Az ilyen prekurzor reakciókra számos példa található az immunkémia területén és a szakember számára nyilvánvalók azok a módszerek, amelyek segítségével az ilyen reakciók felhasználhatók szenzorok - ideértve az immunszenzorokat is - létrehozására, a találmány szerinti enzimelektródok alkalmazásával. A találmány szerinti elektródok primer alkalmazási területe azonban olyan bioszenzorok létrehozása, amelyek egy oxidálható anyag - különösen glukóz - egy mintában, különösen klinikai mintában - amilyen a vér, szérum, plazma, vizelet, izzadtság, könny és nyál - való kimutatására és/vagy kvantitatív meghatározására alkalmasak. Más lehetséges, nem klinikai alkalmazások pl. a következők: a) fermentációk követése, b) üzemi eljárások ellenőrzése, c) a környezet vizsgálata, pl. folyadékok és gázok ellenőrzése a termék-koncentráció és a környezetszennyezés szempontjából, d) élelmiszerek vizsgálata, e) állatgyógyászati alkalmazások, különösen olyanok, amelyek az előbbiekben említett klinikai alkalmazásokhoz kapcsolódnak. Mivel a találmány szerinti enzimelektród anyagot tartalmazó bio- és más szenzorok tartalmazhatnak más szerkezeti elemeket is - amilyenek az elektromos vezetékek, elektromosan nem vezető (szigetelő) hordozók vagy minták, stb. -, meg kell jegyeznünk, hogy az ilyen elemek hagyományos szerkezetűek és részletes leírást nem igényelnek. Elég annyit mondanunk, hogy ha - mint rendesen - az elektródanyaga vékony papírlap vagy érintkezőlemez, a bioszenzor általában magában foglal egy szigetelő hordozó elemet vagy mintát, amelyre az elektródanyagot felszereljük és amelynek segítségével az elektródanyag bevihető a mintába. Ilyen esetekben az elektródanyag darab tényleges mérete egészen kicsi lehet: max. néhány mm2 vagy még kisebb. Az elektród anyagával az elektromos érintkezés többféle módon alakítható ki, pl. oly módon, hogy az elektród anyagát közveüenül érintkeztetjük egy elektromosan vezető érintkezéssel vagy kimenettel, amely pl. platinából, ezüstből vagy más megfelelő vezető anyagból készül. Ha az elektród anyaga kellő vastagságú és szilárdságú ahhoz, hogy az elektród teljesen önálló lehessen, eltekinthetünk a szigetelő hordozók vagy elektród-vivőanyagok alkalmazásától és az elektromos vezetékeket közvetlenül hozzáköthetjük az elektródanyag felületéhez. Elektromosan félvezető felületként - abban az esetben, ha karbonpapírtól különböző hordozóelemet alkalmazunk - pl. egy „terepen használható tranzisztor” (FET) felülete vehető igénybe, de karbonpapírtól eltérő hordozóként elektromosan nem vezető felületet is beiktathatunk. Az utóbbi esetben az elektromos érintkezés közvetlenül a gyantával megkötött szén vagy grafit rétegben jelenlevő platinacsoportbeli fémmel alakítható ki. A találmány szerinti enzimelektród anyagrác előállítását és jellemzőiket a következő példákban mutatjuk be. 1. példa (összehasonlító) 56-163 447 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés szerinti megoldás. A találmány szerinti enzimelektródot állítunk elő oly módon, hogy elektrolízis segítségével vékony (1 pm-nél kisebb) réteg platina fémet viszünk fel egy elektromosan vezető alapra; ez egy porózus, gyantával kötött karbonpapír, amely 30 nm névleges részecskenagyságú (Vulcan XC-72) vezetőképes szénszemcséket (szénkormot) tartalmaz. A koromszemcséket kötőanyagként 10 tömeg% politetrafluoretilén alkalmazásával rögzítjük a kereskedelemben kapható grafitos karbonpapírlapra. Aspergillus nigerből származó glukózoxidázt rögzítünk a platinát tartalmazó karbonpapír különböző darabjain, egyrészt az előbbiekben leírt karbodiimides kezeléssel, másrészt glutáraldehid segítségével keresztkötések kialakításával. Ez utóbbi műveletet úgy végezzük, hogy az elektród platinatartalmú felületét vizes glukózoxidáz oldattal kezeljük, az elektródot szárítjuk, majd a lerakodott enzimmel keresztkötéseket alakítunk ki, glutáraldehiddel, 25 °C-on való kezelés során. A további vizsgálat céljából az elektród anyagot 2 mm átmérőjű korongokra vágjuk fel. 2. példa. Glukóz elektród Aspergillus nigerből származó glukózoxidázt rögzítünk platinát tartalmazó karbonpapíron, amelyet a Prototech Co. (Massachusetts, USA) a „Prototech” kereskedelmi néven hoz forgalomba. Ez platinatartalmú szénpor részecskéket (Vulcan XC-72) tartalmaz, amelyeket a 4 044 193 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példája szerint állítunk elő. Úgy járunk el, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
