202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
7 HU 202 577 B 8 gok, amelyeket a Prototech Company (Newton Highlands, Massachussets) a Prototech védjeggyel hoz forgalomba és amelyeket korábban elektrokatalitikus gázdiffúziós elektródok anyagaként alkalmaztak üzemanyagcellákban. Ilyen anyagok előállítását részletesen ismerteti a 4 044 193; 4 166 143; 4 293 396 és 4 478 696 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a teljesség kedvéért ezekre hivatkozunk. Nagy vonalakban azonban az mondható el, hogy a 15-25 A (1,5-2,5 nm) részecskenagyság tartományba eső méretű kolloid platinát adszorbeáltatnak porított szén felületére (részecskenagyság 50-300 Á, azaz 5-30 nm (pl. oly módon, hogy in situ platina szólt képezünk porított szén jelenlétében, amely magképző ágensként hat a szól vonatkozásában. A platinatartalmú szén részecskéket ezután egy szintetikus gyanta kötőanyag - előnyösen egy fluorozott szénhidrogén gyanta és különösen politetrafluoretilén - alkalmazásával felvisszük egy elektromosan vezető hordozó szerkezetre, pl. egy karbonpapírlapra. Egy másik megoldás szerint - amelyet a 4 293 396 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ír le - a platinát tartalmazó szén részecskéket impregnálással egy előformázott porózus széntextíliára visszük fel, és fluorokarbon gyanta, előnyösen politetrafluoretilén felhasználásával kötjük ahhoz. Magától értetődő azonban, hogy a találmány nem korlátozódik a Prototech anyagok alkalmazására, hanem magában foglalja más hasonló szubsztrát anyagok felhasználhatóságát, amilyen a gyantával megkötött és formába öntött, platina- vagy palládiumtartalmú szénpor. Konkrétan úgy látjuk, hogy olyan típusú anyagok is alkalmazhatók, amelyeket a 4 229 490 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás az üzemanyagcellák tekintetében leír. Ezek közelebbről karbonpapír típusú elektródtúr, amelyek egy - előnyösen egy vízlepergető gyantával, pl. politetrafluoretilénnel - impregnált karbonpapír hordozóelemet tartalmaznak és erre visznek fel - pl. filmnyomásos eljárással - egy gyantával megkötött katalizátor réteget. Ez a réteg egy víztaszító gyantával - előnyösen ugyancsak politetrafluoretilénnel - megkötött platinakorom és szén vagy grafit részecskék homogén keveréke. Az enzimnek a gyantával megkötött, a platina- vagy palládiumtartalmú szénhordozón való rögzítését számos jól ismert rögzítési eljárás segítségével végezhetjük. Ilyen pl. egy karbodiimid vagy egy karbonil-diimidazol reagenssel képezett kovalenskötés kialakítása, kovalenskötés képzése l,6-dinitro-3,4-difluor-benzollal (DFDNB) vagy keresztkötések kialakítása glutáraldehiddel. A következőkben jellegzetes példákat mutatunk be a glukózoxidáz rögzítésére vonatkozó előírások köréből. A. Karbodiimides kezelés 1. Megfelelő méretű elektródokat vágunk ki a Prototech elektród anyagból, amely lapok alakjában áll rendelkezésre. 2. Az elektródokat kb. 5 percen át etanolban tartjuk annak biztosítására, hogy a PTFE-vel bevont rögzítő rész és a hátlap alaposan nedvesedjék. 3. Az elektródokat eltávolítjuk az etanolból és az etanolnyomok teljes eltávolítására alaposan mossuk desztillált vízzel. 4. 0,1 mólos pH 4,5 acetát pufferrel elkészítünk 5 ml (vagy kevesebb) 0,15 mólos l-ciklohexil-3-/2-morfolino-karbodiimid-p-metil-toluol-szulfonát oldatot és az elektródokat 90 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk. Mechanikai keverő segítségével enyhe kevertetést alkalmazhatunk. Ha az elektródok az oldat felületén úsznak, ez azt jelenti, hogy nem nedvesedtek megfelelően, és a kezelést a 2. lépéstől kezdve meg kell ismételni. 5. Az elektródokat kiemeljük, és alaposan mossuk desztillált vízzel. pH 5,6 acetát pufferrel frissen elkészített, 5,0 mg/ml koncentrációjú glukózoxidáz oldatba helyezzük ezeket és enyhe mechanikai kevertetés mellett 90 percen át a rendszert szobahőmérsékleten tartjuk. 6. Az elektródokat kiemeljük az enzim oldatból és alaposan átöblítjük 0,1 mólos acetát pufferrel. Az elektródok ekkor használatra készek. 7. Az elektródokat 0,1 mólos pH 5,6 acetát pufferben 4 *C-on tároljuk. B. Kezelés karbonil-dümidazollal 1. Végrehajtjuk az előbbi 1. lépést, és elhagyjuk a 2. és 3. lépést. 2. Vízmentes dimetilformamiddal elkészítünk egy 40 mg/ml koncentrációjú NJú-karbonil-diimidazol oldatot. 3. Az elektródokat 90 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk, miközben kívánt esetben enyhe mechanikai kevertetést (rázatást) alkalmazunk. 4. Az elektródokat kiemeljük az oldatból és szárítással eltávolítjuk a karbonil-diimidazol oldat felesleget, majd az elektródokat további 90 percre frissen előállított glukózoxidáz oldatba helyezzük. 5. Végrehajtjuk az előbbi 6. és 7. lépést C. Kezelés DFDNB-vel 1. Végrehajtjuk az előbbi A. sorozat 1-3. lépését. 2. Az elektródokat alaposan mossuk 0,1 mólos pH 8,5 nátriumborát pufferrel. 3. Metanollal elkészítünk 5 ml 0,1 mólos 1,6-dinitro- 3,4-difluor-benzol oldatot és az elektródokat 10 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk. 4. Az elektródokat eltávolítjuk, és a boát pufferrel alapsan mossuk, majd további 90 percre szobahőmérsékleten glukózoxidáz oldatba helyezzük. 5. Végrehajtjuk az A. sorozat 6. és 7. lépését A rögzítési eljárásban más típusú kapcsolószerek is alkalmazhatók, ideértve a különböző lánchosszúságú kapcsoló ágenseket, amilyen pl. a diimidátok csoportja (pl. dimetil-malonimidát vagy dimetil-parafasav-imidát). Egy másik megoldás szerint azt találtuk, hogy az enzim egyszerű adszorpciója a gyantával megkötött, platinát vagy palládiumot tartalmazó szénpor felületre (amelynek során nem alakítunk ki keresztkötéseket), hatásosnak bizonyulhat egyes enzimek, konkrétan a glukózoxidáz esetében. A rögzített enzim felületét rendszerint - de nem szükségszerűen - fizikai védelemben részesítjük, egy megfelelően porózus - pl. polikarbonát - film vagy membrán segítségével, amelynek természetesen permeábilisnek kell lennie a meghatározandó enzim szubsztrátja (pl. a glukózra). Ezek a membránok azzal a bizonyos mértékig hátrányos következménnyel járnak, hogy nö-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
