202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására
HU 202558B A találmány tárgya eljárás emlős agyvelőből, különösen szarvasmarha nucleus caudatusából származó, új, makromolekuláris neuronotrófiás faktor (SDNF) előállítására. Kémiai szempontból a tisztított neurotrófiás faktor olyan bázikus fehérje, amelynek izoelektromos pontja pH 10 körül van, SDS gélen elektroforézissel meghatározott móltömege hasonló a lizoziméhoz, vagyis 14 000 és 17 000 dalton között van, átlagértéke mintegy 14 400 dalton. Biológiai szempontból a molekula in vitro növelni tudja az idegrendszeri, elsősorban a központi idegrendszeri neuronok túlélését tenyészetben. A fenti és az említett kémiai és biológiai jellemzők ezt a neuronotrófiás faktort megkülönböztetik, más, korábban közölt és azonosított, makromolekuláris neuronotrófiás faktoroktól. Sőt az SDNF molekula gyógyszerészeti alkalmazását is feltártuk; ezek az alkalmazási formák is részét kepezik a jelen találmánynak. Ismeretes, hogy az emlős sejtek/« vivoésin vitro túlélését és növekedését egy sor specifikus, sejten kívüli, hormonjellegű jelátvivő szabályozza, amelyek növekedési faktorokként ismeretesek, és amelyek többsége fehérje vagy peptid. Biológiaüag mindegyik növekedési faktor a reagáló célsejt egy meghatározott csoportjára hat. Az idegélettani kutatásban ma különös érdeklődésre tart számot azoknak a makromolekuláris, fehérje-jellegű növekedési faktoroknak a vizsgálata, amelyeknek az a feladatuk, hogy az emlősök idegsejtjeinek túlélését és növekedését biztosítsák, mind a fejlődési szakaszban, mind felnőttkorban. WM. Cowan és mts. (Science, 225,1258/1984/) arra az eredményre jutottak, hogy az idegrendszer fejlődése során a közvetlenül a testnedvekből és a sejt mikrokömyezetéből származó, külső előfordulású neuronotrófiás faktorok szabályozzák az idegsejtek túlélését és elpusztulását. Valóban azt tapasztalták, hogy a növekvő neurit hálózatoknak a célsejtből származó neuronotrófiás faktorokért folytatott versengése szabja meg, hogy melyik neuron maradjon életben és melyik pusztuljon el az embriogenezis során. Felnőttkorban hasonló, ha nem is azonos neuronotrófiás faktorokról állapították meg, hogy nélkülözhetelenek az idegsejtek túlélésének fenntartásában és az agyon belüli funkcionális kapcsolatok korrigálásában (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. II, No. 3,1985).Tehátaz idegsejtek fokozatos elgyengülése és pusztulása (amely traumatikus károsodás, patológiás folyamatok, így agyvérzés, neurodegeneratív betegségek vagy öregedés következménye lehet) maga után vonhatja a neuronotrófiás faktorok in vivo kimerülését vagy gátlását (S. Varon: uott; S.H. Appel: Aim. Neurol., 10,499 /1981/; S. Varon és mts.: Dev. Neurosci., 6,73/1984/). Ekutatók azt is közölték, hogy a felnőtt emlősök neuronotrófiás faktorai a kiindulópontjai a károsodást követő helyreállásnak és regenerálódásának, nemcsak a perifériás, hanem a központi idegrendszerben is. A korszerű idegélettani eljárások alkalmazása az állatok központi idegrendszerében végrehajtott átültetési és károsító kísérletekben valóban megerősítette azt az elképzelést, hogy felnőtt emlősök központi idegrendszerében lehetséges a neuronok helyreállítása, feltéve, hogy a 1 megfelelő trófiás jelátvivők rendelkezésre állnak (FH. Gage és mts.: Nature, 308,637 /1984/). A legutóbbi időkig az egyetlen jóldefiniált, makromolekuláris, fehérje-jellegű neuronotrófiás faktor az idegnövekedési faktor (NGF) volt (R. Levi- Montalcini és mts.: Physiol. Rev., 48,534/1968/); R. Levi-Montalcini: Ann. Rev. Neurosci., 5, 341 /1982/). Az a felismerés, hogy az NGF csak korlátozott számú emlős 0610*00 típus túlélését képes serkenteni/» vitro ősin v/vo, arra az elképzelésre vezetett, hogy az NGF a makromolekuláris neuronotrófiás faktorok családjának csupán egyik tagja, és mindegyik tag meghatározott neuron típusok túlélését tudja szabályozni. Eddig csak két másik, makromolekuláris, neuronotrófiás faktort sikerült tisztán kinyerni és jellemezni: a dliáris neuronotrófiás faktort (CNTF) (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. II, No. 3,1985; S. Varon és mts.: Dev. Neurosci., 6,73/1984/) és az agyvelőből származó neuronotrófiás faktort (BDNF) (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. II, No. 3, 1985; Y. Barde és mts.: Embo J., 1,549 /1982/). E faktorok forrásait, kémiai jellemzését és biológiai aktivitását az alábbiakban bemutatjuk. Bebizonyosodott, hogy neuron rendszerek/« vitro tenyészetei alapvető és nélkülözhetetlen eszközei a neuronotrófiás aktivitás vizsgálatának szövetkivonatokban és ama komplex folyamatok nyomonkövetésének, amelyek alkalmasak a neuronotrófiás faktorok frakcionálására és tisztítására. Kimutatták, hogy a mitózis után disszociált neuronok egyrétegű tenyészete, amelyet in vitro kellőképpen „korlátozó” tenyészeti körülmények között tartottak, igényelte a tenyészethez kívülről hozzáadott trófiás segédanyagot, és reagált is rá. A neuronotrófiás aktivitás tehát hatásosan meghatározható félig tisztított vagy tisztított, nyers preparátumokban az idegsejt túlélés serkentő képesség/« vitro nyomonkövetésével. Sőt a morfológiai kritériumok alátámasztására vagy megerősítésére specifikus idegsejt jelzők (pl. az idegszál tartalom analízise vagy specifikus felfogó markerek) is használatosak. Amint korábban jeleztük, az eddig azonosított, makromolekuláris, neuronotrófiás faktorok az idegnövekedési faktor (NGF), a dliáris neuronotrófiás faktor (CNTF) és az agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (BDNF). Mindegyikük biológiai forrásait, kémai jellemzését és biológiai aktivitását az alábbiakban ismertetjük. Az idegnövekedési faktort (NGF) eredetüeg egerek szarkóma daganataiban fedezték fel (R. Levi- Montalcini és mts.: J. Exp. Zool., 116, 321 /1951/), majd homogén, tisztított állapotban hím egerek állkapocs alatti nyálmirigyből (S. Varon és mts.: Biochemistry, 6,2202 /1967/) és kígyóméregből (RJL Angeletti: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 65, 668 /1970/) nyerték ki. Az NGF sok más gazdag forrását is ismertették, így a tengerimalac prosztatát (G.P. Harper és mts.: Nature, 279,160/1979/) és az emberi méhlepényt (L.D. Goldstein és mts.: Neurochem. Rés., 3,175/1978/). Kismennyiségű NGF jelenlétét észlelték más szövetekben is, így emlősök központi idegrendszerében (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. H, No. 3,1985; F. Hefti és mts.: Neuroscience, Vol. n, No. 3,1985: F. Hefti és mts.: Neuros-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
