202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására
HU 202558B cíence, 14,55 /1985/). A fiziológiai összefüggés az NGF e lehetséges forrásai és hatóterületei között nem egészen világos, de általában feltételezik, hogy az NGF-et különféle perifériás szövetek választják ki, amelyek innervációjához NGF-re reagáló sejtekre van szükség. A hím egerek állkapocs alatti mirigyeiből nyert NGF szekvencia-analízisét és klónozását is végrehajtották (J. Scott és mts.: Nature, 302, 538 /1983/); A. Ulrich és mts.: Nature, 303, 821 /1983/). Az emberi béta-NGF gént is sikerült izolálni és klónozni (A Ulrich és mts.: Nature, 303,821 /1983/; European Pat. No. 0121388). Az NGF legteljesebb kémiai jellemzését az egerek állkapocs alatti mirigyeiből kinyert típuson végezték el. Az egérmirigy NGF 7S fehérjekomplexként hat (móltömege mintegy 140 000 dalton) és három különböző alegységből áll (alfa, béta, gamma), amely Znz+ iont tartalmaz. Az NGF-aktivitás kizárólag a béta-alegységgel kapcsolatos (2,5S NGF- ként ismeretes), amely bázikus, dimer, 25 300 dalton móltömegű fehérje (SDS gélen végzett elektroforézis során 12 650 dalton móltömeget mutat), amelynek izoelektromos pontja mintegy 9,3. A hím egerek állkapocs alatti mirigyeiből és emberi forrásokból származó béta-NGF szekvenciáit is leírták (J. Scott és mts.: Nature, 302,538/1983/); A Ulrich és mts.: Nature, 303,821 /1983/). Az NGF biológiai aktivitásának legtöbb in vitro és in vivo vizsgálatára is az egér állkapocs alatti mirigyéből származó NGF-et használták Az NGF in vitro biológiai aktivitásának hatókörét primer idegsejteken és tenyészetbeli klónozott sejteken egyaránt meghatározták. Eszerint a primer idegsejtek/« vitro reagálnakazNGF-re. Ezt teszik a fötális érző idegsejtek (8-12 napos embrióknál) a dorzális gyökér-ganglinokban, a fötális autonom mellékvese-neuronok szimpatikus ganglinokban, fötális kolinerg idegsejtek a rekeszfalban és a klórmaffin mellékvese sejtek fejlődésük közben. Míg az érző és szimpatikus idegsejtek túlélése és fejlődése függ az NGF-től, a kolinerg idegsejtek láthatólag nem igényelnek NGF-et a túléléshez, csupán a differenciálódásukhoz, vagyis fenotípusos jellemvonásaik kifejeződése kapcsolódik a neurotranszmitterhez. NGF hozzáadása a mellékvese krómaffin sejtjeihez (az idegcsúcsból származó sejtek) fejlődésük kezdeti szakaszán az idegsejt fenotípusainak kifejeződését okozza. Az NGF-re in vitro reagálónak mondott, klónos sejtek az idegcsúcs daganatokból származó, krómaffin mellékvese-sejteket (úgynevezett feokromocitoma sejtek, PC12) és emberi neuroblasztoma sejteket foglalják magukban. NGF-fel végzett kezelés után ezek a sejtek az erősen sarjadzó formájukból átmennek mitózis utáni idegsejt állapotba. Az NGF-re in vivo reagálónak talált neuronok a háti gyökér-ganglionok érző idegsej tjei, a központi idegrendszer szimpatikus és kolinerg neuronjai akár a fejlődés során, akár a felnőttkort követő károsodásokban. Ez utóbbi esetben az NGF intracerebrális adagolása elősegítette az idegsejtek túlélését és a jellegzetes fenotípusos vonások kifejeződését. Ezek a hatások összefüggésben vannak a károsodás által kiváltott viselkedési változások javulásával. A ciliáris neuronotrófiás faktort (CNTF) először 3 csirkeembriók szemszövetéből (Es) mutatták ki és izolálták tisztán. Ezek a szövetek a szivárványhártya érhártyájából és cüiáris testjéből, továbbá ezek pigmentáló epitáliumából származtak. Később CNTF-aktivitást találtak különféle szövetkivonatokban is, így felnőtt patkányok ülőidegeiben és ugyancsak patkányok központi idegrendszerének sebnedveiben. A kémiai jellemzéshze a CNTF-et csirkemagzat szemen belüli szöveteiből nyerték Id tisztán (fehérjére számítva mintegy 2.10"4, trófiás aktivitásra nézve pedig 9% mennyiségben). SDS gélen végzett elektroforézissel móltömegét 20 400 daltonnak találták, izoelektromos pontja pedig pH 5 körül van. Ez a móltömeg és ugyancsak a tisztán negatív töltés egyértelműen megkölünbözteti a CNTF-et az egerek szubmandibuláris fehérjéjétől, a béta-NGF-től. A csirkeszemből kinyert CNTF szekvenciáját nem közölték és emlősökből származó CNTF-et sem sikerült preparatívméretekben elkülöníteni. A CNTF biológiai aktivitásának vizsgálatát főképpen csirkeszem kivonatokból származó, félig vagy teljesen tisztított CNTF preparátumokban végezték, kizárólag/« vitro. Az in vitro reagáló neuronok a következők voltak: Cüiáris ganglionok csirkemagzatból (Es), csirkemagzat háti gyökérganglionjainak neuronjai (Eio), újszülött egér háti gyökérganglionjainak neuronjai, Ei i csirke-ganglionok és újszülött patkány ganglionok szimpatikus neuronjai. Azt is leírták, hogy egyik Uyen aktivitás sem volt blokkolható vagy gátolható az egerek szubmandibuláris béta-NGF-jének antitestjeivel. A CNTF in vivo hatásáról nincs adat. Az agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (BDNF) aktivitását patkányok C6 klónos sejtvonalából származó, kondicionált közegekben és más fajok agyvelőkivonataiban vizsgálták. A faktort tisztán felnőtt sertésagyvelőből nyerték ki. A felnőtt sertésagyvelőből "tisztán kinyert BDNF (fehérjére számítva 3,8.10 , trófiás aktivitásra nézve kevesebb, mint 5% mennyiségben) erősen bázikus polipeptid (izoelektromos pontja 10,1 feletti), SDS gélelektroforézissel megállapított móltömege mintegy 12 300 dalton. Szekvenciáját nem közölték az irodalomban. A BDNF molekulát és extrakciójának eljárását a DE 3213963 Al. számú NSZK-beli szabadalmi leírás adja meg. A BDNF biológiai aktivitásának vizsgálatát kizárólag in vitro végeztek sertésagyvelőből származó nyers kivonatban, valamint félig vagy teljesen tisztított BDNF preparátumokban. Kimutatták, hogy mind a plakoidból, mind az idegcsúcsokból származó érző neuronok túlélését, továbbá in vitro retina explantátumok neurit-kinövéseit és sejt túlélését elősegíti a BDNF (J.E. Turner: Develop. Brain Res., 18,251 /1985/; J-E. Turner: Develop. Brain Res., 18, 265/1985/).Noha aBDNF kémiai tulajdonságai nagyon hasonlóak a béta-NGF-éihez, immunológiai keresztreakcióját nem mutatták ki, sőt a szimpatikus neuronokra sem hat. A BDNF in vivo hatásáról semmüyen közlemény nem jelent meg. A találmány eljárás az új, 14 000 - 17 000, átlagosan mintegy 14 400 dalton móltömegű, 9,5 és 10,5 pH közötti izoelektromos pontú, az idegrendszer, különösen a központi idegrendszer neuronjai-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
