202554. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipofil fehérjék tisztítására
HU 202554B 1 A találmány tárgya eljárás HBsAg fehérje kinyerésére és tisztítására. A találmány tárgya eljárás részben az oldott fehérje sejtmaradványból való kinyerésére, részben pedig fehérje szelektív extrakciójára. A diganosztikában, a gyógyászatban, a kémiában és így tovább széles körben alkalmazott peptidek és fehérjék előállítására gyorsan elterjedt a DNS rekombinációs technológia. Gyakran merül fel az a probléma, hogy a kívánt fehérje tisztított formában mentes legyen az előállításakor keletkező szennyező fehérjéktől. A találmány a DNS rekombinációs technika fejlesztésére irányul. A jelen találmány tárgya tehát eljárás a kívánt - genetikaüag módosított élesztőkultúrák segítségével termelt-fehér jék hathatós kinyerésére. Azt tapasztaltuk, hogy a genetikaüag módosított Pichia törzsek segítségével termelt lipofil HBsgAg fehérjék szelektíven kinyerhetők kaotropikus sókat tartalmazó lizáló puffer felhasználásával. A Pichia törzs roncsolódása a lizáló puffer jelenlétében csökkenti az extrahált fehérjék teljes mennyiségét, ugyanakkor alig hat a kívánt lipofil HBsAg fehérje extrakciójára. A találmány szerint előállított sej tkivonatban több a lipofil HBsAg fehérje, mint az extraktumban levő egyéb fehérje, s így egyszerűsödik a kívánt lipofü HBsAg fehérje további tisztítása. A találmány szerinti eljárással kapcsolatba hozható a Biochim.Biophys Acta 507,416(1984) /C A. 101, 225 094n (1984)/ cikkben ismertetett megoldás, melyben élesztő 80 S riboszomojának kaotróp sókkal végzett disszociációját, továbbá a riboszomális fehérje rRNS elválasztására szolgáló eljárást ismertetnek, továbbá a FEBS Letters 158, 53-57 (1983) cikk, melyben élesztőből származó RNS-nek a nukleoprotein komplextől való, kaotróp sókkal végzett disszociációját ismertetik (lásd 54. oldal, bal oszlop, utolsó bekezdés). A fenti két cikkben ismertetettekből nem lehet arra következtetni, hogy kaotróp sók alkalmazásával Pichia törzsbeli gazdasejtekből alipofil, a sejt lipidmembránjához kötődő HBsAg fehérjét a leírásban ismertetett előnyös módon lehet kinyerni. A találmány szerint a Pichia törzs gazdasejtjei által előállított HBsAg fehérjéket a következők szerint extraháljuk: a sejtek 60-100%-át elroncsoljuk 5-9 pH-értékű oldatban, amely 1-5 mól/1 koncentrációban alkálifém-halogenidet és/vagy alkálifém-rodanidot tartalmaz, majd a kapott keverékből az oldott frakciót kinyerjük és kívánt esetben betöményítjük. Az előzőek szerint kapott oldható frakciót - összhangban a jelen találmánnyal - ismert módon tovább kezelhetjük a kívánt fehérje további koncentrálására és tisztítására. Az oldható frakcióban levő fehérje töményíthető dialízissel, fordított fázisú gyantán keresztül minimális térfogatú oldószeres clucióval, továbbá kicsapással, ultraszűréssel, liofilizálással és így tovább. A kívánt fehérje további tisztítására szolgáló technikák közé tartozik a méret szerinti frakcionálás, amelyre felhasználhatunk méretspecifikus gyantákat, nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás, ioncserés, hidrofób kromatográfiát és így tovább. A találmány értelmében a kaotropikus sóként 2 olyan sókat alkalmaznak, amelyek anionjai képesek apoláris csoportokat vízbe juttatni. Ilyen sók azok, amelyek rodanidiont, halogén-ionokat, így jodidot és bromidot, valamint kationokat, így például alkálifémionokat tartalmaznak. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kaotropikus sókra a következő példákat nevezzük meg: nátrium-rodanid, kálium-rodanid, nátriumjodid, kálium-jodid, lítium-klorid, lítium-bromid. A lipofü fehérjék Pichia nemzetséggel történő előállításakor a kívánt fehérjéket kódoló megfelelő DNS szekvenciákkal genetikaüag módosítottuk a Pichia gazdasejteket. A kívánt fehérjét kódoló megfelelő DNS szekvenciák a technika állásából ismertek, így például természetes forrásból izolálhatok, szintetikus DNS szekvencia kialakítható. Pichia nemzetségbe történő DNS manipulálásra speciális módszereket közöl a Molecular and Cellular Biology folyóiratban megjelent cikk (1111. és 3376. oldal, 1985). A találmány szerinti extrakciós eljárást a sejtek roncsolásával valósítjuk meg, olyan hosszú ideig végezve a műveletet, amíg a teljes sejttömeg elroncsolódik. A sejtroncsolást olyan extrakciós közegben valósítjuk meg, amely 1-5 mól/1 koncentrációban legalább egy kaotropikus sót tartalmaz, pH-ja pedig a kívánt fehérje stabü formájának megfelelően 5-9, előnyösen 6-8. Az extrakció során a fehérje degradálódását csökkenthetjük, ha anti-proteázt, így például fenil-metil-szulfonil-fluoridot adunk a lizáló pufferhez. A találmány szerinti eljárásban a sejtroncsolást golyósmalomban vagy hasonló berendezésben homogenizálással végezzük. A sejtroncsolás idejét a sejtfal szuszceptibilitása, a homogenizálás erőssége, a lizáló pufferhez adott komponensek, illetve azok koncentrációja határozza meg. A sejtroncsolást 0,5-30 percig, előnyösen 1-5 percig végezzük. A sejtroncsolás hőmérsékletét úgy határozzuk, hogy a fehérjét károsító enzimek működése minimális legyen. így a műveletet általában 0 és 10 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 0 °C körüli hőmérsékleten folytatjuk le, hogy a sejtroncsolás során minimálisra csökkenjen le, hogy a sejtroncsolás során minimálisra csökkenjen a kívánt fehérje károsodása, s ezáltal az elroncsolt sejtekből növekedjen a kívánt fehérje kitermelése. Először összetörjük a sejteket, majd az oldható frakciót valamilyen ismert módszerrel, például centrifugálással vagy tangenciális szűréssel eltávolítjuk a sejttörmeléktől. Ha szükséges az így kezelt közeget tovább kezelhetjük, hogy a kívánt lipofil fehérjét koncentráltabb formában nyerjük ki. Erre a célra különböző ismert technikát alkalmazhatunk, így például savas kicsapást, szűrést, kromatografálást, oldószeres bepárlást. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül a következő példákkal szemléltetjük. 1. Példa A p BSAG (5) vektorral (E. coli gazdasejtből, letéti szám: NNRLB-18021,,.Northern Regional Research Center of the US Department of Agriculture, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
