202554. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lipofil fehérjék tisztítására

HU 202554B

3

Peoria, 111.) átalakított Pichia sejtekből történő 22 nm-es hepatitis B felületi antigén (HBsAg) extrakcióját a következők szerinti végezzük.

10-100 optikai sűrűség egység (600 nm/ml) sejtsűrűségű P. pastoris tenyészetet készítünk. 100 op- 5 tikai sűrűség egységnek megfelelő aliquotot egy 13 x 100 mm-es boroszilikát tenyésztő csőbe viszünk, és 20 térfogatrész lizáló pufferrel a következő leírás szerint kétszer mossuk.

A szemcsés sejtekhez (EEC klinikai centrifuga) 10 0,5 g savasan mosott üveggyöngyöt (0,5 mm) és 0,35 ml lizáló puffert adunk. A lizáló puffer kontrollként vagy 0,5 M nátrium-kloridot és 0,1%-os Triton X- 100 (vegyes%) tartalmaz, vagy 2 M ül. 3 M kaotropikus sót 0,1%-os Triton X-100-zal vagy anélkül. 15 Mindegyik oldatot 10 mM nátrium-foszfáttal pH - 7,5-re pufféról juk. Az elegyet egy perces időközönként maximális fordulatszámú keverővei nyolcszor megkeverjük. A keverés szüneteiben az elegyet legalább 1 percig jéggel hűtjük. A csöveket előnyösen 20

4

20-40”-os szögbe helyezzük miközben a keverés hatására a maximális sejtroncsolás megvalósul.

A lizálás után az összetört sejteket eltávolítjuk, az üveggyöngyöket 0,35 ml lizáló pufferrel mossuk, majd a két oldatot összeöntjük és 15 percig 1300 gvel centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és immunoreaktív HBsAg részecskékre (Ausria vizsgálat) és teljes fehérjére (Bradford) vizsgáljuk. Az eredményeket az I/a. táblázatban közöljük.

2. Példa

A találmány szerinti eljárásban 88 ml szuszpenziót (egy rész sejt/2 rész lizáló puffer v/v) sejtroncsolóban (Impandex, Inc.) 64 mm-es 4500 fordulat/perc fordulatszámú keverő tárcsával kezelünk. A lizáló puffer vagy 0,5 M nátrium-kloridot és 0,1%os Triton X-t (vegyes%) vagy 3 M kálium-rodanidot tartalmaz, a felülúszót HBsAg-re (Ausria) és teljes fehérjére (Bradford) vizsgáljuk. Az eredményeket azl/b. táblázatban közöljük.

I. Táblázat

Lizálási

körülmények

HBsAg részecske (p-g/ml)

Teljes protein (mg/ml)

HBsAg/protein

tömeg%)

(a) Só (koncentráció) NaCl(0,5M)

+ Triton

230

10,1

2,3

KI(2M)+Triton

14

1,4

1,0

KI(2M)-Triton

169

2,4

7,0

KSCN(3M) + Triton

10

1,9

0,5

KSCN(3M) - Triton

222

3.5

6,3

(b) Sejtroncsolás NaCl (0,5M)

+Triton

600

32,5

1.8

KSCN(3M)

803

10,6

7,6

A kaotropikus sók alkalmazása esetén a HBsAg kitermelés nem nő szignifikánsan a kontrolihoz képest (I.oszlop), azonban vüágosan kitűnik, hogy a 45 kaotropikus sók gátolják a teljes fehérjemennyiség kibocsátását (ILoszlop), ennélfogva a HBsAg specifikus aktivitása 2-5-szörösére nő (HI.oszlop),

50

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Pichia nemzetségbe tartozó gazdasejtekből HBsAg fehérjék kivonására, azzal jellemezve, hogy a sejtek 60-100%-át elroncsoljuk 5-9 pH- 55

értékű oldatban, amely 1-5 mól/1 koncentrációban alkálifém-halogenidet és/vagy alkálifém-rodanidot tartalmaz, majd a kapott keverékből az oldott frakciót kinyerjük és kívánt esetben betöményítjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- 60

mezve, hogy a közeg pH-ját 6-8-ra állítjuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtroncsolást 0-10 °C hőmérsékleten 0,5-30 percig végezzük.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkálifém-halogenid és/vagy alkálifémrodanid sóként a következő vegyületek valamelyikét, vagy ezekből kettő vagy több vegyület keverékét alkalmazzuk:- nátrium-rodanid -kálium-rodanid- nátrium-jodid -kálium-jodid -lítium-klorid -lítium-bromid.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldott frakciót az elroncsolt sej teket tartalmazó oldat centrifugálásával nyerjük ki.

3