202515. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új forszkolinszármazékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 202515B I. táblázat folytatása (Vila) általános képletű vegyületek 3 4 Avegyület száma R2 A (VHa) általános képletben R4 44. (d) képletű csoport-COCH3-CH2CH3 45.-CO(CH2)2N(CH3)2-COCH3-CH2CH3 48.-CO(CH2)2NHCH3-COCH3-CH-CII2 49.-CO(CH2)2NH2-COCH3-CM-CH2 ♦Kiindulási anyagul szolgáló vegyületek A találmány szerint előállított vegyületek fiziológiás hatását a következő módon vizsgáljuk. 1. Pozitív inotróp aktivitás és vérnyomáscsökkentő aktivitás 20 A vizsgálatban beagle vagy vegyes tenyészetből származó felnőtt, hím vagy nőstény kutyákat használunk. Pentobarbitál-nátriumos anesztézia mellett a nyaki verőéren át az állatok bal kamrájába polietilén csövet helyezünk, amely a bal kamra belső nyo- 25 másának mérésére szolgál. Ugyancsak polietilén csövet helyezünk az állatok femorális artériájába, hogy a vérnyomást mérhessük. Minden polietilén csövet nyomás-transzduktorhoz kapcsolunk, és a nyomást folyamatosan regisztráljuk nyúlásméré- 30 sen alapuló nyomásmérő eszközön át csatlakoztatott regisztráló készüléken. Ezen kívül a bal kamra belső nyomásának a növekedési ütemét (dp/dt) is meghatározzuk, nyomásváltozást mérő műszerrel, és az előzőekben ismertetett módon folyamatosan 35 regisztráljuk, ez szolgál az inotróp aktivitás indexeként. A vizsgált vegyületek aktivitását a forszkolin által adott maximális hatáshoz való viszonyításukkal jelezzük. Azt a maximális növekedési sebességet (dp/dt) és azt a maximális átlagos vérnyomás csők- 40 kenést (MBP), amely 30 p.g/kg forskolin intravénás adagolásának eredményeként jelentkezik, 1 -nek tekintjük, a vizsgált vegyületek aktivitását 300 fig/kg vagy 30 p-g/kg vizsgálandó vegyület intravénás adagolásakor jelentkező hatás fenti hatáshoz való vi- 45 szonyításával nyerjük. 2. Aldenüát-cikláz stimuláló aktivitás Autentikus adenilát-cikláz-mintaként tengerimalac szívizom homogenizátumból származó membrán-frakciót alkalmaztunk [lásd G.I. Drum- 50 mond, D. L. Severson és L. Kuncan, J. Bioi. Chem., 246,4166(1971)]. Jelzett ATP szubsztrátból adenilát-cikláz által előállított jelzett cAMP-t Salomon és munkatársai eljárásával határozunk meg [Y. Salomon, C. Londos, és M. Rodbell, Anal. Biochem., 5&, 541 (1974)]. 5 mmól/1 magnézium-kloridot, 20 mmól/1 kreatinfoszfátot, 100 V/ml kreatin-foszfokinázt, 1 mmól/1 cAMP-t, 1 mmól/1 [14C (U)] ATP-t (kb. 7 cpm/pmól és forszkolint vagy valamely vizsgálandó vegyületet 1 pjnól/1 mennyiségben tartalmazó pH 7,5-es 25 mmól/l-es trisz-HCl puffer oldathoz az autentikus enzim hozzáadásával megindítjuk a reakciót. A reakcióelegy teljes térfogata 100 pl. Az autentikus enzimet 150-200 p.g/100 pl membránfehérje mennyiségben alkalmazzuk. A reakcióelegyet 10 percig 37 'C hőmérsékleten tartjuk, majd a reakciót 100 pl pH 7,5-es leállító oldattal leállítjuk. Ez utóbbi oldat 2% nátrium-dodecü-szulfátot (SDS), 40 mmól/1 ATP-t és 1,4 p.mól/1 cAMP-t tartalmaz. Ezután 50 pl pH] cAMP-t (kb. 20000 cpm) adunk hozzá a kapott cAMP %-os mennyiségének mérésére. Ezután a cAMP-t kromatográfiásan Dowex 50 gyantaoszlopon és semleges alumínium-oxid oszlopon kromatografálva izoláljuk, és a cAMP radioaktivitását meghatározzuk. A vizsgálandó vegyületek (1 pjnól/1) adenilát-cikláz stimuláló hatását a forszkolin (1 pjnól/1) aktivitáshoz viszonyítva százalékos értékben adjukmeg[n-4 (n«6a 10 és 17., n-2 a 38., 39., 41. és 42. mintála-a) átlagérték ± standard deviáció], AH. táblázatban az 1. és 2. vizsgálatok eredményét mutatjuk be néhány jellemző, a találmány szerint előállított vegyületre. II. táblázat Forszkolinszármazékok fiziológiás hatásai Avegyület 1. Pozitív inotróp és vérnyomáscsökkentő hatás 2. Adenilátcikláz száma* Dózis Pozitív Vérnyomásaktiváló hatás (p.g/kg,i.v.) inotróp csökkentő (%) hatás hatás (dp/dt) 10. 300 U 2,0 90,4 ± 4,7 11. 300 0,8 1,2 45,1 ± 6,9 12. 300 0,8 1,0 40,2 ± 7,1 17. 30 1,2 0,8 107,4 ± 7,1 3
