202502. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 3,5-dihidroxikarbonsavak és származékai, valamint e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 202502B Braude, J.Hannah,R. Linstead, J. Chem. Soc. I960. 3257). A közbenső termékek tisztítását szükség szerint desztillációval, krsitályosítással vagy gyors kromatografálással vagy nagynyomású folyadék-kromatografálással végezzük. Biológiai tesztrendszerek: 1. HMG-CoA-reduktáz-hatás enzimkészítményekben A HMG-CoA-reduktáz-hatást patkányok májmikroszómáiból nyert szolubüizált, azaz oldhatóvá tett enzimkészítményeken mértük, melyeket kolesztiraminnal (RCuemid) indukáltunk a nappal-éjjel ritmusban történő átállítás után. Szubsztrátként (S,R)14C-HMG-CoA szolgált, a NADPH koncentrációját az inkubálás alatt regenerált rendszerrel tartottuk fenn. 14C-mevalonat elválasztását a szubsztráttól és más termékektől, például 14CHMG-től oszlopeluálással végeztük és az eluálási profilt mindenegyes mintánál megállapítottuk. 3H- mevalonát állandó alkalmazásától eltekintettünk, mert a meghatározásnál a gátló hatás viszonylagos megadásáról van szó. Egy kísérletsorozatban mindig egy enzimmentes kontrollt egy enzimtartalmú normális anyagot (100%), valamint a találmány szerint előállított készítmény adalékokat kezeltük együtt a végső koncentráció 10'5—10"9 mól. Minden egyedi értéket 3 paralell minta átlagértékéből képeztünk. A középérték-különbségek szignifikanciáját a készítménymentes és a készítménytartalmú minták között t-teszttel határoztuk meg. A fent leírt módszer szerint a találmány szerűit előállított vegyületek HMG-CoA-reduktázra gyakorolt gátlási értékeit megállapítottuk (ICso/mól/liter a vegyület 1 literre eső moláris koncentrációja, amely 50% gátló hatás előidézéséhez szükséges). A 13 b-k példákban az IC50 értékeket lxlO'9 és lxlO'8 közöttinek találtuk, speciálisan a 13 a példánál ez az érték l,7xl0'9 és a vegyület racém formában fordul elő. A 19a. példa szerinti vegyület IC50 értéke 1,3x10 . 2. A HMG-CoA-reduktáz elnyomása ill. gátlása HEP-G2-sejtek sejttenyészeteiben Lipoproteinmentes táptalajban HEP-G2-sejtek monorétegeit a tesztanyag megfelelő koncentrációival bizonyos ideig, például 1 óra hosszat előinkubál iuk, majd a jelzett prekurzor hozzáadása, például r4C-nátriumacetát hozzáadása után az inkubálást folytatjuk, például 3 óra hosszat. Belső standard (3H-koleszterin) hozzáadása után a sejtek egy részét lúgosán elszappanosítjuk. Az elszappanosított sejtek lipidjeit kloroform-metanol elegyével extraháljuk. Ezt a lipid-elegyet hordozó-koleszterin hozzáadása után preparatív vékonyréteg-kromatográfiásan elválasztjuk, a koleszterinsávokat jód-gőzzel láthatóvá téve izoláljuk és a 4C-prekurzorból keletkezett 14C-koleszterin mennyiséget szintigrafiásan meghatározzuk. A sejtek aliquot részében meghatározzuk a sejtproteint úgy, hogy 1 mg sejtproteinre időegységenként keletkezőTM 4C-koleszterinmennyiséget kiszámolhassuk. Ezt az értéket összehasonlítjuk az ugyanígy kezelt, azonban tesztanyagot nem tartalmazó tenyészetben 1 mg sejtproteinre és időegységenként keletkezett mennyiséggel és így 5 kapjuk a teszt-készítmény gátló hatását aHEP-G2- sej ttenyészetnek koleszterin-bioszintézisére is. Az anyagok vizsgálata koleszterin-biosztintézis gátlására sejttenyészetekben HEP-G2-sejtek konfluens sejttenyészete (monorétege) 1. lipoproteinmentes közeg (DMEM) 24 h 2. ajeszt-készítménnyel történő inkubálás lh 3. 4C-acetáttal inkubálás 3h 4. citolízis 5. reakció-termékből14C-koleszterin elválasztása vékonyréteg-kromatográfiásan 6.14C-koleszterin izolálása 7. Szcintillációs mérés 8. Eredmény 14C-koleszterin/mg sejtprotein nmól oldószerkontrollal összevetve A fent leírt módszerrel a találmány szerint előállított vegyületek koleszterin-bioszintézis-gátló értékeit állapítottuk meg (HEP-G2-sej tekben) az (ICso/mól az a vegyületkoncentráció, amely a koleszterin-bioszintézist 50%-kal gátolja. Ezeket a gátló értékeket a 13b-k példák termékeinél 10~7 és 10‘9 mól/liter értékek között találjuk különösen a 13a. példa esetében ez az érték 5xl0"8 mól/liter, a 19a. példa esetében 2^x10*° mól/liter. Az (I) és (10 általános képletű vegyületek a HMG-CoA-reduktáz erős gátlásával a koleszterinbioszintézis sebességmeghatározó enzimjének gátlásával tűnnek ki. Az ICso értékek literenként 10"7—10*9 mól értékei az (0 ül. (D) általános képletű vegyületek esetében lényegesen jobb gátlást mutatnak, mint az irodalomból ismert teljes szintézissel előállított HMG-CoA-reduktáz-inhibitorok, mint például amelyeket G. E. Stokker és társai írtak le a J. Med. Chem. 22.170 (1986) irodalmi helyen. A HMG-CoA-reduktáz enzim a természetben széles körben elterjedt. Katalizálja a mevalonsav keletkezését HMG-CoA-ból. Ez a reakció a koleszterin-bioszintézis központi lépése. (JJC Sabine in CRC Series in Enzyme Biology. 3-Hydroxy-3- methylglutaryl Coenzym A Reductase, CRC Press Inc. Boca Raten, Florida 1983 (ISBN 0-8493- 6551-1). A magas koleszterinszint számos betegséggel együtt jár, mint például a koszorúér szívbetegség vagy az arterioszklerózis. Ezáltal a magas koleszterinszint lecsökkentése az ilyen betegségek megelőzésének és kezelésének gyógyászati célja. Ehhez kiindulási pontként szolgál az endogén koleszterinbioszintézis gátlása, ill. csökkentése. A HMG-CoA-reduktáz gátló anyagok gátolják egy korai lépésben a koleszterin-bioszintézist. Ezáltal az (I) ill. (II) általános képletű vegyületek antihiperlipidémiás szerekként és az arterioszlderotikus elváltozások kezelésére, illetve megelőzésére alkalmazhatók. Eszerint a találmány kiterjed az ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, különösen hipolipidémikumok és arterioszklerotikus elváltozások megelőzésére szolgáló gyógyászati készítményeket állítunk elő. Az (I) ill. (II) általános képletű vegyületek alkalmazása orális dózisban 3-2.500 mg, előnyösen 10-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
