202406. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Lumbricidae családba tartozó gilisztafélékből eikozapentaénsav-észter tartalmú zsír elegy - és adott esetben ebből eikozapentaénsav tartalmú zsírsav elegy - előállítására
1 HU 202406 A 2 A találmány tárgya eljárás a Lumbricidae családba tartozó gilisztafélékből eikozapentaénsav-észter tartalmú zsírelegy - és adott esetben ebből eikozapentaénsav tartalmú zsírsav elegy - előállítására. Az elmúlt években igen elterjedt eljárás az istállótrágyából történő humusz előállítás. A folyamat földigiliszták közreműködésével történik. A giliszták táplálkozásuk során az istállótrágyából humuszt állítanak elő és ugyanakkor ők maguk is szaporodnak. A gilisztaállomány egy év alatt hat-tízszeresére szaporodik. így világszerte problémát okoz a nagytömegű földigiliszta feldolgozása, hasznosítása a humusz előállításától eltérő célra. A 81 144 703 számú japán nem vizsgált közrebocsátási irat eljrárást ismertet földigiliszták haltáp céljára történő feldolgzására. Az eljárás során a földigilisztát mossák, szárítják és kiszerelve haltápként alkalmazzák. A 85 109 664 számú kínai közrebocsátási irat olyan eljárást ismertet, melynél a tenyésztett földigilisztát mossák, sósavval 110 “C-on 48 órát hidrolizálják és a szűrletből elektrolízis és kénhidrogénes fémeltávolítás után aminosavakat állítanak elő. A 3 306 944 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat eljárást ismertet földigiliszták legalább 50 tömeg % vizet tartalmazó oldattal való vizes-oldószeres extrakciójára, vérkoagulációt gátló anyag előállítása céljából. A nedves vagy szárított, célszerűen zsírtalanított, gilisztát az eljárás során vizes-oldószeres, célszerűen fiziológiás nátrium- klorid vagy 5-10 közötti pH-értékű egyéb vizes pufferoldat és poláros oldószer, előnyösen etil-alkohol, elegyével extrahálják. így egy olyan proteint vagy „kvázi”-proteint tudnak kinyerni, amely fibrinolitikus aktivitással rendelkezik és a fibrint indirekt módon oldani képes. Kísérleteink során azt találtuk, hogy a Lumbricidae családba tartozó gilisztafélék, különösen az Eiseniafoetida, az Eisenia andrei (Eisenia foetida var Andrei), a Lumbricus rubellus, a Lumbricus terrestis, zsírtartalmának jelentős hányada eikozapenténsav-észter, amely egy speciális eljrással jó kitermeléssel kinyerhető. Különösen az Eisenia foetida rendelkezik jelentős eikozapenténsav-észter tartalommal. A gilisztafélék eikozapenténsav tartalmának egyrésze azonban olyan glicerinészter alakjában van jelen, ahol a glicerin egyik hidroxilcsoportja foszforsavszármazékkal van észterezve. Ennek kinyerése jelentős problémát okoz és vizes-oldószeres extrakcióval, illetve egyszerű extrakciós módszerrel nem lehetséges. Célul tűztük ki, hogy eljárást dolgozunk ki, amellyel gilisztafélékből jó kitermeléssel eikozapentaénsav-észter tartalmú zsírelegyet és kívánt esetben ebből eikozapentaénsavban dús zsírsav elegyet állítunk elő. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy jó kitermeléssel a Lumbricidae családba tartozó gilisztákból úgy állítható elő eikozapentaénsav, ha a mosott, belülről kitisztított gilisztákat előbb enzimmel emésztjük. Az enzimes emésztésnél célszerűen proteáz és/vagy foszfolipáz-C enzimet alkalmazunk. A több órás enzimes emésztés után az elegyet kívánt esetben szárítjuk, pl. liofilezéssel, porlasztva szárítással, majd ezután az így nyert terméket zsíroldószerrel vagy szén-dioxiddal extraháljuk. Ez utóbbi extrakciót az ismert szuperkritikus technikával végezzük. Ilyen szuperkritikus extrakciót ismertet például a 4 675 132 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A találmány szerinti eljárással olyan zsírelegy állítható elő, amelynek 15-22 tömeg %-a eikozapentaénsav (EPA) glicerinészter alakjában. Az eljárás melléktermékeként kapott extrakciós maradék pedig oldószermentesítés után, takarmányozási célokra használható, mint fehérjében dús elegy. A találmány szerinti eljárásban az emésztő enzimeket a giliszta száraz tömegére nézve 0,1-1,5 tömeg %-ban alkalmazzuk. Az enzim szerepe az, hogy a giliszta sejtmembránját megbontsa és így ki tud szabadulni a sejtekbe zárt szerkezeti olaj. A foszfolipáz-C ezen túlmenőin a foszfolipidek bontását is elvégzi. Az extrakcióban zsíroldószerként előnyösen kloroformot, alkoholokat, előnyösen metanolt, diklór-metánt, dietilétert, ciklohexánt, hexánt, stb. alkalmazunk. Előnyösen az extrakciót folyékony szén-dioxiddal végezzük szuperkritikus körülmények között. Az extrakció során nyert zsír-elegy 16-18 szénatomszámú telített zsírsav frakciót és egy 18-20 szénatomszámú telítetlen zsírsav frakciót tartalmaz - mindkettőt glicerin-észter fontjában. Az eikozapentaénsavat a következőképpen jelöljük: 20:5:co3, ahol 20 a szénatomszámot, az 5 pedig a kettőskötések számát jelenti, 3 pedig az utolsó kettős kötés mögötti telítetett szénlánc szénatomjainak számát. A földigiliszta szárazanyagtartalmának 8-9 tömeg %-a zsiradék és ebben 15—22 tömeg % az EPA-tartalom glicerin-észter alakjában. Eljárásunkban előnyösen az Eisenia foeitida-féléket dolgozzuk fel. Ennek szaporítását célszerűen az alábbi módon végezzük. Az alommal kevert szarvasmarha trágyát betonfelületen vagy 15 cm magasan kiemelt és fóliával takart földfelületen 0,8-1,0 méter magas és 1,5 m széles prizmákba rakjuk. Megvárjuk, amíg a trágyaprizma hőmérséklete 20 °C-ra lehűl. Ezután 80 mázsa trágyába egy millió glilisztát telepítünk egyenletesen. Szükség esetén a trágyahalmazt öntözzük a szükséges nedvességtartalom fenntartása céljából. A trágyába helyezett giliszták 6 hónap alatt dolgoznak fel 80 mázsa trágyát humusszá, miközben számuk 6-10 millióra szaporodik. A komposztot és a gilisztákat úgy választjuk szét, hogy a munkafelületet fóliával letakarjuk. A giliszták a letakarás után a felső komposzt rétegből az alsó komposzt rétegbe menekülnek és így a komposzt jelentős része gilisztamentesen eltávolítható. Ezt a műveletet többször megismételjük. Amikor ez a művelet már nem folytatható a megmaradt gilisztás komposztot dobszitán giliszta tömegre és komposztra választjuk szét. Az így előállított gilisztát dolgozzuk fel a találmány szerinti eljárásban. A találmány tárgya tehát eljárás a Lumbricidae családba tartozó gilisztafélékből eikozapentaénsavészter tartalmú zsírelegy - és adott esetben ebből eikozapentaénsav tartalmú zsírsav elegy - előállítására, a giliszta vizes mosása, szárítása, mad extrakciója és az extrakt oldószermentesítése révén. Az eljárást az jellemzi, hogy a vizes mosással tisztított gilisztát nedves papírlemezek között tartjuk 4-10 °C-on 40-48 órán át, majd a belülről is megtisztított 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
