202324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz meghatározására alkalmas diagnosztikai reagens előállítására
1 HU 202 324 B 2 A találmány tárgya új eljárás glükóz módosított Trinderreakcióval való meghatározására alkalmas diagnosztikai reagens előállítására, mely 4-amino-fenazont, foszfát-puffer-oldatot, nátrium-azidot, enzim-katalizátorokat, timolt és detergenst tartalmaz. Ismert, hogy a biológiai minták (vér, vizelet) glükóz tartalmának meghatározása a klinikai kémiai laboratóriumok egyik leggyakoribb feladata. Az eddig ismert módszerek közül kiemelkedő az ún. Trinder-féle színreakción alapuló metodika [Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969)]. A módszer lényege az, hogy a 4-amino-fenazon (kémiai nevén: l-fenil-2,3-dimetil-3-amino-pirazolin-5-on) fenollal (később különböző fenol-származékokkal) a glükózból származó atomos oxigén jelenlétében reagáltatva intenzív színű terméket hoz létre, mely jól fotomctrálható. Az igen széles körű publikációkból csak a legutóbbit kiemelve, például a 188 953. számú magyar szabadalmi leírás szerint timolt (2-izopropil-5-mctil-metilfenolt) használnak reaktánsként. Bár ez a timol-tartalmú reagens kétségtelen előnyöket hozott a fenol-származékokat, szalicilsav-származékokat és egyéb komponenseket tartalmazó eljárásokkal szemben, legfőképpen abban, hogy stabil, nem fényérzékeny jól mérhető terméket hozott létre, jelentős hátrányokkal is rendelkezik. A reagens ugyanis a timol oldatban tartására és oldására etilalkoholt tartalmaz, és ez komoly problémákat okoz az olyan fotométereknél és analizátoroknál, amelyeknek polisztirol küvettáik vannak (pl. a Hitachi analizátor). A szerves oldószerek ugyanis feszültségi korróziót okoznak a polisztirolnál és a küvetták megrepedeznek, ugyanakkor a timolos reakcióban képződött színes termék mosószerekkel ki nem mosható elszineződést okoz és így a hibátlan sorozat-mérés nem valósítható meg. E tényeken nem változtat az a módosítás sem, hogy a reagenshez kis mennyiségű Brij-35 detergenst célszerű adni, a vérszérumok közvetlen bemérésekor előálló enyhe zavarosság elkerülésére. A találmány célja tehát olyan eljárás kidolgozása, amellyel a timolos színreakció előnyei megtarthatók, de az etanol használatából adódó hátrányok kiküszöbölhetők. Kísérleteink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy amennyiben a timol-rcagenst egy jól behatárolt, sajátos arányú aceton-emulgens-desztillált víz elegyében oldjuk, ahol is az aceton a reagensre vonatkoztatva legfeljebb 0,5% alatti koncentrációban van jelen, a fenti cél jól megvalósítható. Felismertük azt is, hogy az emulgens karaktere is fontos a kedvező eredmény szempontjából, nevezetesen szorbitánészter-polioxietilén-monolaurát típusú emulgensre van szükség. Ezen reagens összetétel és emulgens használata mellett ugyanis a küvetták repedése és elszíneződése nem következik be. A találmány tehát eljárás a glükóz meghatározására alkalmas 4-amino-fenazont, foszfát-puffer-oldatot, nátrium-azidot, enzimkatalizátorokat, timol-reagenst és detergenst tartalmazó diagnosztikai reagens előállításával, olyan módon, hogy 100 tömegrésznyi 0,8 ± 0,2 mmól/1, 4-amino-fcnazont, 15,4 ±0,1 mmól/1 nátrium-azidot, 0,08 ± 0,02 mól/1 foszfát-puffért, 10 000 ± 1000 NE/I glükózoxidázt, 15 000 ± 1000 NE/1 peroxidázt tartalmazó oldatot 3-5 tömegrésznyi 65 ± 5 mmól/1 timolt, 1,7 ± ± 0,1 mól/1 acetontés 14-15 tf% szorbitánészter-polioxietilén-monolaurátot tartalmazó oldattal összekeverünk. A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a mérőreagenst két oldatból készítjük úgy, hogy az 1. oldat 100 résznyi mennyiségéhez 4 rész 2. oldatot adunk, majd elkeverjük. Az 1. oldat enzimeket tartalmaz alapoldatban. Az alapoldat összetétele: Foszfát-puffer: 0,08 ± 0,02 mól/1 4-aminofenazon: 0,8 ± 0,2 mmól/1 Nátriumazid: 12,3 ± 0,1 mmól/1 Ezt követően 10400 NE glükózoxidáz- és 15 600 NE peroxidáz enzimet feloldunk 1000 ml alapoldatban. A 2. oldatot úgy készítjük, hogy a timolt egy meghatározott arányú oldószer-keverékben oldjuk. Az egyes anyagok koncentrációi a 2. oldatban és a kész reagensben: 2. oldat: Reagens: timol: 65 mmól/1 2,5 ± 0,2 mmól/1 aceton: 1,7 mól/1 65,0 ± 0,3 mmól/1 szorbitán-észter-polioxietilén-monolaurat 14,6 térf.% 0,56 ± 0,04 térf.% (Twcen20) A találmány szerinti eljárás előnyeit az alábbiakban részletezzük: 1. Eljárásunkban tenzidként Tween 20-at (szorbitán-észter-polioxietilén-monolaurat) alkalmaztunk, de céljainknak a többi kereskedelmi forgalomban lévő Tween nevű készítmény is megfelel (Tween 21,40, 60, 61, 65, 80, 81, 85). Használatával hármas cél érhető el: 1.1. Biztosítjuk a timol oldását alkohol nélkül, igen kis mennyiségű aceton felhasználásával, elkerülve ezzel a polisztirol küvetták korrózióját és elszíneződését 1.2. Megakadályozzuk használatával a szérumok által okozott zavarosság létrejöttét. 1.3. Megoldható az átfolyós rendszereknél fontos ' tisztító hatás. 2. Közismert dolog, hogy a detergensek elősegítik a reagensek időbeni spontán elszíneződését Uj eljárásunkat a timol tartalmú (lásd 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás) reagenssel hasonlítottuk össze, amely 20% etilalkoholt és 0,35% Brij-35-öt tartalmaz; Desztillált vízzel szemben az abszorbeiós maximumokon mértük az extinkciókat a reagensek elkészítése után. Találmányunk szerinti reagens 188 953 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti reagens Összeöntés után 0,025 0,050 10 perc után 0,035 0,070 30 perc után 0,050 0,080 90 perc után 0,055 0,085 Másnap reggel, hűtő tárolás után 0,080 0,130 Az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a Tween 20 elszíneződést okozó hatása kisebb, mint a Brij-35-é, így a vele készült reagens alkalmasabb a tárolásra és az automata analizátoroknál kisebb hibát okoz. 3. A glükóz meghatározás kalibrációjából származó adatok, amelyeket az új reagenssel Hitachi-704 analizátoron nyertünk, jobb mérőkarakterisztikát mutatnak, mint az alkohol tartalmú reagensé (lásd 1. sz. táblázat). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
