202323. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására
5 HU 202 323 B 6 zel szemben a találmány szerinti eljárásban az érzékenység növekedése éppen a BO/T érték növelésével érhető el, ezáltal a radioaktivitás-mérésből eredő hiba sem növekszik. A radioimmun meghatározások előtt a mérendő biológiai mintákból a hatóanyagot megfelelő módszerrel kivonjuk és a méréshez szükséges mértékig tisztítjuk. A találmány szerinti eljárás előnyeit a következőkben foglaljuk össze: Az alkalmazott szekvenciális telítési analízis segítségével a 125I-PGE2-TME rádióiigandumon alapuló heterológ, egyensúlyi radioimmunoassay-hez képest jelentős érzékenységnövekedés érhető el. Ennek alapvető jelentősége abban áll, hogy ily módon valóban elérhető, vagy megközelíthető az a kimutatási határ, amelyet a jód-125-tel jelzett tracer fajlagos aktivitása elméletileg biztosítani képes. Az egyensúlyi RIA-nál lényegesen nagyobb érzékenységet érhetünk el még olyan körülmények között is, amikor az antitest koncentrációja esetleg nem elég nagy a hideg antigén 100%-os kötésének biztosítására, de a hideg antigénnel való előinkubáció és a traccrrel való inkubáció idejét és hőmérsékletét, valamint az antitest koncentrációját optimálisan választjuk meg. Az eljárás további előnye, hogy nemcsak a találmányi leírás példájában ismertetésre kerülő konkrét anti-PGE2 nyúl antitestre alkalmazható, hanem bármely állatfajból nyert, akár különböző immunspecificitású antitesteket tartalmazó ún. poliklonális, akár egyetlen antitestet termelő sejtből származó és így egyfajta immunspecificitással rendelkező ún. monoklonális antitest esetében, amennyiben ezeknek 125I-PGE2-TME tracerre vonatkozó egyensúlyi állandója nagyobb a PGE2 kötődés egyensúlyi állandójánál. A fokozott érzékenység lehetővé teszi a minta mennyiségének a csökkentését, amely körülmény a mintában lévő különböző szennyező anyagok zavaró hatásának csökkentése szempontjából alapvető fontosságú. Az alkalmazott szekvenciális telítési analízis azon jellemző vonása, hogy az antitest koncentráció növelésével - az egyensúlyi módszerrel ellentétben - növekszik az érzékenység, kedvező irányban befolyásolja a PGE2 radioimmun meghatározásának kritikus matematikai-statisztikai paramétereit (pontosság, reprodukálhatóság) is, amely - részben az igen alacsony hatóanyagkoncentrációk, részben a PGE2 kémiai tulajdonságai miatt - a PGE2 mérésénél ugyancsak kulcskérdés. A találmány szerinti eljárás tehát gyakorlati szempontból megőrzi az eddig kizárólagosan használt egyensúlyi radioimmunoassay fő jellemzőit, külön reagenseket, berendezéseket, lényeges feldolgozásbeli módosítást nem igényel, és a meghatározási idő kis mértékű növekedése is elhanyagolható az egész eljárás idejéhez képest. Ez lehetővé teszi az egyensúlyi meghatározás azonnali felváltását a leírt szekvenciális módszerrel anélkül, hogy annak költségigényét növelné. A találmányt a továbbiakban konkrét példa alapján magyarázzuk, amelyre a találmány oltalmi köre természetesen nem korlátozódik. Példa Humán vérplazma prosztaglandin E2 tartalmának meghatározása A meghatározás előtt a kísérleti alanyokból a vért oly módon nyerjük, hogy műanyag kémcsövekbe 9 térfogatrész vérre számítva 1 térfogatrész - 2% etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 1 mmól indomctacint tartalmazó - izotóniás sóoldatot pipettázunk, a vért erre gyűjtjük, és azonnal centrifugáljuk 0 "C-on, kb 1000 x g gyorsulással 10 percig, majd a plazmát elválasztjuk. A plazmamintákat ezután oldószeres extrakciónak vetjük alá, a következő módon. 1 ml plazmához hozzáadunk 100 mikroliter 2 mólos citromsav oldatot, majd az elegyet injekciós fecskendőbe pipettázzuk, és átnyomjuk a fecskendőre helyezett ún. „fordított fázisú” szilikagélt tartalmazó műanyag patronon (Sep-Pak C18, Waters Ass., USA gyártmány), amelyet előzőleg a gyártó cég használati utasítása szerint előkészítettünk. A tölteten ezután ugyanazon fecskendővel átnyomunk 10 ml desztillált vizet, 10 ml 10%-os etilalkoholt és 10 ml petrolétert. Ezeket a folyadékokat elöntjük, majd a patronon 10 ml etil-acetátot nyomunk át, amelyet műanyag kémcsőbe gyűjtünk, hozzáadunk 1 ml desztillált vizet, kémcsőkeverővei néhány másodpercig kevertetjük, majd a vizes fázist pipettával alulról kiszívjuk, és elöntjük. Ezt a műveletet még egyszer megismételjük, majd az etil-acclátos oldatot Rolavapor típusú forgóbepárló készüléken (Büchi, Svájc) 30-35 °C hőmérsékleten vákuumban szárazra pároljuk és Rí A pufferben oldjuk. 1 ng/ml koncentrációjú standard PGE2 törzsoldatból pufferes hígítást készítünk úgy, hogy 1-1 ml térfogatú mintákat kapjunk, amelyek hatóanyag-koncentrációja 3,7-11,1-33,3-100-300 pg/ml. A standard oldatokból és a fenti módon előkészített meghatározandó minták pufferes oldataiból 100-100 mikrolitert sorszámozott műanyag kémcsövekbe automata pipettával bemérünk, majd hozzáadunk 100 mikroliter antiszérumot olyan hígításban, amely a tracemek 30-40%-át képes megkötni. A nem-specifikus kötődés (NSB) meghatározására további kémcsövekbe az antiszérum helyett 100 mikroliter tiszta puffer-oldatot teszünk, míg a specifikus kötés (B/T) meghatározására a standard oldatok helyett is tiszta puffer-oldatot adunk az antitesthez. A teljes radioaktivitás (TC) meghatározása ugyanilyen összetételű csövekből történik. Minden egyes mérési ponthoz három párhuzamost (három azonos reagensösszetételű kémcsövet) használunk, és valamennyi kémcsőben a reakcióelegy térfogatát a szükséges térfogatú puffer hozzáadásával 300 mikroliterre egészítjük ki. Valamennyi reagens (tracer, antitest, standardok és minták) oldásához és a térfogatkiegészítéshez 0,05 mólos, 7,4 pH-jú, 0,1% zselatint tartalmazó foszfát puffert (RIA puffert) használunk. A reagensek összemérése után a kémcsövek tartalmát kémcsőkeverővei néhány másodpercig kevertetjük, majd lezárjuk, és hűtőszekrényben 0-4 ‘C közötti hőmérsékleten éjszakán át állni hagyjuk. Ezután valamenynyi csőbe bepipettázunk 100 mikroliter 12ÍI-PGE2-TME traced (MTA Izotópkutató Intézete, Budapest terméke), amelynek radioaktivitása 30 000-40 000 cpm/100 mikrolitcr, és néhány másodpercig kémcsőkeverővei kevertetjük. A kémcsöveket ezután újra lezárjuk, és az előbbiek szerint 2 órán át inkubáljuk. Ezután a TC csövekhez hozzáadunk 500 mikroliter hideg RIA-puffert, a többi csőhöz pedig 500 mikroliter csontszén szuszpenziót, amelyet a hozzáadás közben jeges-vizes fürdőn mágneses keverővei erősen kevertetünk. A szén szuszpenzió összetétele: 0,01 mólos foszfát puffer (pH 7,4) 0,5% Dextran T-70 (Pharmacia, Finnország) és 1% Norit-A (Serva, NSZK). A kémcsöveket 10 percig 0 *C-on cent5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
