202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
17 HU 202288 B 18 triptofén operon (trp po) expressziós kontrollszekvenciája. A replikációra és expresszióra élesztőben alkalmas vektorok élesztó-replikációs start( pont )ot és az élesztő számára szelektív genetikai markert tartalmaznak. Az élesztőreplikáció startpontját tartalmazó hibridvektorok, például a kromoszómális autonom replikálódó szegment (ars), a transzformáció után az élesztősejten belül extrakromoszomálisak maradnak és a mitóziskor önállóan replikáidnak. Továbbá alkalmazhatunk élesztő 2 ju-plazmid-DNS-sel homológ szekvenciákat tartalmazó hibridvektorokat. Ezek a hibridvektorok rekombinációval a sejten belül már meglévő 2 /u-plazmidokba épülnek be vagy önállóan replikáidnak. A 2 p-szekvenciák különösen a nagy transzformáció-gyakoriságú plazmidokhoz alkalmasak és nagyszámú másolat képzését biztosítják. Az élesztőhöz alkalmas jelzógének mindenekelőtt azok, amelyek antibiotikus rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának, vagy auxotróf élesztőmutánsok esetében a gazda defektusát komplementéi gének. Megfelelő gének például cikloheximid antibiotikum elleni rezisztenciát kölcsönöznek vagy gondoskodnak a prototrofiáról auxotróf élesztőmutánsokban, ilyen például az URA3-, LEU2-, HIS3- vagy mindenek előtt a TRP1- -gén. Továbbá az élesztő-hibridvektorok előnyösen a baktériumgazda, különösen E.coli számára replikációs startpontot és egy jelzőgént tartalmaznak, így a hibridvektorok és előtermékeik szerkesztése és klónozása egy bakteriális gazdában történhet. Az élesztőben expresszióra alkalmas expressziós kontroliszekvenciák például a TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03- vagy PH05-gén kontrollszekvenciái, továbbá a glükolizisben résztvevő promoterek, például a PGK- és GADPH-promoter. A találmány különösen olyan replikációra és fenotipusos szelekcióra alkalmas expreszsziós vektorokra vonatkozik, amelyek expressziós kontrollszekvenciát és a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mimellett az említett DNS-szekvencia a transzkripció start- és stopjelével, valamint a transzláció start- és stopjelével együtt az említett expressziós kontroliszekvencia szabályozása alatt az említett expressziós plazmidban olyan elrendezésű, hogy az említett plazmiddal transzformált gazdában deszulfatohirudin fejeződik ki. Hatékony expressziót akkor érünk el, ha a deszulfatohirudin-gén az expressziós kontrollszekvenciával megfelelően (.fázisban") helyezkedik el. Az expressziós kontrollszekvenciát előnyös a fő-mRNS-start és a gént kódoló szekvencia ATG-je közötti tartományban, amely természetesen az expressziós kontrollszekvenciával össze van kötve (például a ís-lac-kódszekvencia, ha ű-lac-promotert alkalmazunk), a saját transzlációs startjelét (ATG) és transzlációs stopjelét (például TAG) tartalmazó deszulfatohirudin-génnel összekapcsolni. Ezáltal biztosított a hatékony transzkripció és transzláció. Például egy vektort, különösen a pBR322-t, restrikciós endonukleázzal hasítunk és adott esetben az így kapott linearizált vektor modifikálása után abba megfelelő restrikciós végekkel ellátott expressziós kontrollszekvenciát juttatunk. Az expressziós kontrollszekvencia a 3’-végen (a transzláció irányába) restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáját tartalmazza, úgy, hogy az expressziós kontrollszekvenciát mór tartalmazó vektor az említett restrikciós enzimmel emészthető és az illeszkedő végekkel rendelkező deszulfatohirudin-gén beilleszthető. Ekkor két hibridplazmid keveréke képződik, amelyek a gént megfelelő, illetve nem megfelelő orientációban tartalmazzák. Előnyös az expressziós kontrollszekvenciát már tartalmazó vektort még egy második restrikciós endonukleázzal a vektor-DNS-en belül elhasítani és a képződött vektor-fragmentbe a megfelelő végekkel ellátott deszuifatohirudin-gént beilleszteni. A vektoron előnyösen minden műveletet oly módon végzünk, hogy a replikon és legalább egy jelzőgén funkciója ne csökkenjen. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában egy pBR322-ből származó vektort, amely expressziós kontrollszekvenciával, különösen a triptofán operonéval (trp po) - amely a 3’-végen (a fő-mRNS-start és az első ATG között) egy előnyösen kohéziv végeket képző restrikciós endonukleáz például Eco Rí felismerési szekvenciáját hordozza - rendelkezik, az említett restrikciós endonukleázzal és a vektor-DNS részben egy tompa vagy előnyösen kohéziv végeket képző második restrikciós endonukleázzal, például Bam HI-gyel emésztünk, majd az így linearizált vektort a megfelelő végekkel rendelkező deszulfatohirudin-génnel (például Eco Rl-véggel az ATG-startkodon előtt és Bam Hl-véggel a transzláció stopkodon ja után) kapcsoljuk össze. Az összekapcsolás ismert módon a komplementer (kohéziv) végek párképzésével és például Tí-DNS-ligázzal való kezeléssel történik. A mRNS-úton át, a genomból származó DNS-ból vagy szintetikusan előállított, megfelelő kohéziv (különösen Eco Rí- és Bam HI-) végekkel ellátott deszulfatohirudin-gén az expressziós plazmidba való bevitel előtt vektorban is, például pBR332-ben, klónozható, hogy nagyobb mennyiségű deszulfatohirudin-gént kapjunk, például szekvenciaanalízis céljára. A hibridplazmidot tartalmazó kiónokat például deszulfatohirudin-génspecifikuB, radioaktív jelzett oligodezoxinukleotid-próbóval (lásd fent) izoláljuk. A deszulfatohirudin-gén jellemzése például Maxam és Gilbert (11) eljárásával történik. A találmány egyik további kiviteli formájában a deszulfatohirudin-gén két fragmensét szintetizáljuk. A gén 1. részét tartal5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
