202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
19 HU 202288 B 20 mazó 1. fragmens az ATG előtt és a végen mindig kohézív végeket képző restrikciós endonukleázok, példéul az ATG előtt Eco Rí és a végen Eco RII felismerési szekvenciáját tartalmazza. A gén következő részét tartalmazó 2. fragmenst megfelelő felismerési szekvenciákat tartalmaz, a fragmens elején például Eco RII és a transzláció stopjele (például TAG) után Bam Hl felismerési szekvenciát. A fragmenseket a külső felismerési szekvenciánál (az 1. fragmen6 Eco RI-gyel és a 2. fragmenst Bam HI-gyel) hasítjuk és egy megfelelően hozzájuk hasított vektorban (például pBR322) szubklónozzuk. A fragmenseket tartalmazó kiónok azonosítása és a fragmensek jellemzése a fenti módon történik. A fragmenseket ezután a megfelelő restrikciós endonukleázzal kihasítjuk a hibridvektorokból (az 1. fragmentet például Eco RI-gyel és Eco RII-vel és a 2. fragmentet Eco RII-vel és Bam HI-gyel) és kohézív végeiken, különösen Eco Rll-végeiken keresztül összekapcsoljuk ezeket, mimellett a teljes deszulfatohirudin-gént kapjuk, amit a megadott módon vektor-DNS-be illesztünk. A mikroorganizmusok transzformációja A találmány eljárás transzformált gazdasejtek előállítására, úgy, hogy valamely gazdát expresssziós kontrollszekvenciával szabályozott, a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós plazmiddal transzformálunk. Alkalmas gazdasejtek például a fenti mikroorganizmusok, így a Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis és különösen az Escherichia coli törzsei. A transzformációt a találmány szerinti expressziós plazmiddal például az irodalomban leírt módon végezzük, például S. cerevisiae-re (12), B.subtilis (13) és E.coli-ra (14). A transzformált gazdasejteket előnyösen szelektív táptalajból izoláljuk, amelyhez olyan biocid anyagot adunk, amivel szemben az expressziós plazmidban található jelzőgén rezisztenciát kölcsönöz. Ha előnyösen az expressziós plazmid ampB-gént tartalmaz, akkor ennek megfelelően a tápleveshez ampicillint adunk. Az expressziós plazmidot nem tartalmazó sejtek ilyen táplevesben elpusztulnak, A találmány az említett úton előállított transzformált gazdasejtekre is vonatkozik. A transzformáit gazdasejtek tenyésztése és deszulfatohirudin kinyerése A transzformált gazdasejtek hirudin-aktivitású polipeptidek előállítására alkalmazhatók. A találmány tárgya eljárás ezeknek a vegyületeknek az előállítására, úgy, hogy a transzformált gazdasejteket tenyésztjük és a terméket a gazdasejtekból szabaddá téve izoláljuk. .Hirudin aktivitású vegyületek' alatt olyan, az említett transzformált gazdasejtekböl kifejeződött polipeptideket értünk, amelyek trombingátló hatást és az antihirudin-antitestekkel pozitív reakciót mutatnak és amelyek a deszulfatohirudin primer struktúrájával vagy egy abból levezetett struktúrával rendelkeznek. A deszulfatohirudin primer struktúrájából levezetett struktúrája deszulfatohirudin vegyületek alatt módosított deszulfatohirudin vegyületeket értünk, mimellett a deszulfatohirudin molekula módosítását előnyösen a deszulfatohirudin primer struktúrájának például az N-terminálison 1-10, különösen 1-6 aminosavval és/vagy a C-terminálison 1-6, különösen 2 aminosavval való megrövidítése vagy az N-terrainálison végzett módosítás, például N-terminális acetilezés vagy metionilezés jelenti. A találmány mindenekelőtt eljárás hirudin aktivitású vegyületek és sóik előállítására, azzal, hogy valamely expressziós plazmiddal - ami expressziós kontrollszekvencia által szabályozott hirudint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz - transzformált gazdasejteket aszszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztünk és a terméket a gazdasejtekból szabaddá teszszük és izoláljuk, és ha szükséges az eljárással kapott terméket a diszulfidhidak felnyitására alkalmas redukálószerrel elegyítjük és a kapott redukált polipeptidet a diszulfidhidak újbóli összekapcsolására alkalmas oxidálószerrel kezeljük és kívánt esetben a kapott hirudin-származékot egy másik hirudin-származékké alakítjuk, és kívánt esetben az eljárással kapott hirudin-aktivitású vegyületek keverékét az egyes komponensekre szétválasztjuk és/vagy kívánt esetben a kapott sót szabad polipeptiddé és a kapott polipeptidet annak sójává alakítjuk. VValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCys- LeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGlu- LysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGlu- GluIleProGluGluWleuGln (XIV) A találmány különösen ejárás (XIV) általános képletű hirudinszármazékok - a képletben V jelentése Val vagy Met-Val é6 W jelentése Tyr vagy Tyr(-0S03H)- és sóik előállítására. A találmány eljárás főleg (XIV) általános képletű deszulfatohirudin - a képletben V jelentése Val és W jelentése Tyr - előállítására. A találmány szerint előállított hirudin aktivitású vegyületekben, különösen a (XIV) általános képletű vegyületekben a Cys ciszteincsoportok előnyösen ugyanolyan elrendezésben, mint a természetes hirudinban páronként diszulfid-hidakat képeznek. A találmány szerint a transzformált gazdasejteket önmagában ismert módon tenyésztjük. Előnyös szénforrások például az asszimilálható szénhidrátok, igy a glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
