202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
15 HU 202288 B 16 A találmány egyik kiviteli formájában a leirt módon állítjuk elő a deszulfatohirudin-gén két fragmensét, különösen a (III), illetve (IV) általános képletű Fi és F2 fragmenseket. A szükség esetén alkalmas vektorban szubklónozható fargmensek a kapcsolódó végeken előnyösen mindig egy restrikciós endonukleáz, különösen Eco RII, felismerési szekvenciáját tartalmazzák, ami miatt az említett restrikciós enzimmel való hasitás és a két fragmens összekapcsolása után a korrekt kódoló deszulfatohirudin-DNS-szekvencia képződik. Az 1. fragmens a transzláció startjele (ATG) előtt és a 2. fragmens a transzláció stopjele (például TAG) után kiegészitóleg .terminális" restrikciós helyeket tartalmaz, amelyek a deszulfatohirudin-gén, illetve a deszulfatohirudin-gén fragmenseinek alkalmas vektorba való beépítését megengedik. Például a találmány a deszulfatohirudin-gén két (III), illetve (IV) általános képletű Fi és F2 fragmensben való előállítására vonatkozik, amelyeket adott esetben szubklónozunk és Eco RII restrikciós enzimmel való hasítás és összekapcsolás után korrekt deszulfatohirudin-DNS-szekvenciát kapunk, és amelyekben Fi-n a transzláció startjele előtt egy Eco Rí restrikciós hely és F2-n a transzláció stopjele után egy Bam Hl restrikciós hely található. Egy előnyös kiviteli formában (e2 eljárás) két-két oiigodezoxinukleotidot, amelyek alternetív módon a kódoló és a komplementer szálból származnak, legkevesebb 3, előnyösen 8-15 komplementer bázissal anellálunk, DNS-polimerázzal, például a fentiek egyikével feltöltünk és T4 DNS-ligázzal deszulfatohirudin strukturgénné kapcsolunk Ö6sze. A hirudin gént kódoló aminosav-szek véneiét tartalmazó expressziós vektorok előállítása A találmány továbbá olyan expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek a deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazzák, amelyeket egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy ezzel az expressziós vektorral transzformált gazdában hirudin aktivitású polipeptid termelődjön. A találmány szerinti expressziós vektorokat például oly módon állítjuk elő, hogy az expressziós kontrollszekvenciát tartalmazó vektor-DNS-be úgy illesztjük a deszulfatohirudint kódoló DNS-szekvenciát, hogy ezt az expressziós kontrollszekvencia szabályozza. Az alkalmas vektor megválasztása a transzformációhoz tervbe vett gazdasejtböl következik. Alkalmas gazdák például a mikroorganizmusok, így az élesztők, például Saccharomyces cerevisiae, és különösen azok a baktériumtörzsek, amelyek nem tartalmaznak restrikciós vagy modifikációs enzimet, mindenek előtt az Escherichia coli törzsei, például az E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli W3110a102, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA221(30) vagy E.coli K12 törzs 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilis, Streptococcus és mások, továbbá magasabb organizmusok sejtjei, különösen az elfogadott humán vagy állati sejtvonalak. Előnyös gazdamikroorganizmusok az E.coli említett törzsei, különösen az E.coli HB101, E.coli JA221 és E.coli W3110 A 102. Alapvetően minden olyan vektor alkalmas, amely a találmány szerinti heterolog, a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát a választott gazdában replikálja és kifejezi. Például a deszulfatohirudin-gént E.coli törzsben kifejező vektorként alkalmasak a X bakterriofágok, például a bakteriofág származékai, vagy plazmidok, így különösen a colEl plazmid és származékai, például a pMB9, pSF2124, pBR317 vagy pBR322. A találmány szerinti előnyös vektorokat a pBR322 plazmídból vezetjük le. Az alkalmas plazmidok teljes replikont tartalmaznak és egy jelzógént, ami az expressziós plazmiddal transzformáit gazda szelekcióját és azonosítását egy fenotipusos jegy alapján lehetővé teszi. Az alkalmas jelzógének például rezisztenciát kölcsönöznek a gazdának nehézfémekkel, antibiotikumokkal és hasonlókkal szemben. Továbbá a találmány szerinti előnyös vektorok a replikon- és jelzőgén-tartományokon kívül tartalmazzák a restrikciós endonukleázok felismerési szekvenciáit, igy ezekre a helyekre a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvencia és adott esetben az expressziós kontrollszekvencia beilleszthető. Az előnyös vektor, a pBR322 plazmid, intakt replikont, tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztenciát kölcsönöz jelzógéneket (tét* és amp*) és egy sor egyszer előforduló felismerési szekvenciát tartalmaz restrikciós endonukleázok, például PstI (az ampE-génben hasit, a tet*-gén érintetlen marad), BamHl, HindlII, Sáli (mind a tet*-génben hasítanak, az amp8-gén érintetlen marad), Nrul és EcoRI számára. A deszulfatohirudin-expressziójának szabályozásához több expressziós kontrollszekvencia alkalmazható. Különösen a transzformálandó gazda erősen kifejeződő génjeinek expressziós kontrollszekvenciáit alkalmazzuk. A pBR322 hibridvektor és az E.coli gazdamikroorganizmus esetében például a laktóz operon, triptofán operon, arabinóz operon és hasonlók, a /i-laktamáz gén expresBziós kontrollszekvenciái (melyek többek között a promotert és a riboszomális kötőhelyet is tartalmazzák), a X N fág génjének vagy a fd fág burokfehérje-génjének megfelelő szekvenciái és mások alkalmasak. Míg a pBR322 plazmid már tartalmazza a fl-laktamáz gén (B-lac-gén) promoterét, a többi expreszsziós kontrollszekvenciát be kell vinni a plazmidba. A találmány szerint előnyös a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
