202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
49 HU 202288 B 50 csapjuk. A kicsapott DNS-keveréket a 10c) példában megadott módon T4-DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük. Az oldatban ily módon rekombináns plazmid képződik, amely beillesztett Fx-F2-DNS-t (deszulfatohirudin-gén) tartalmaz. d) Az E.coli HB101 transzformációja a pML- 310 plazmiddal A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leirt módon történik. A 13c) példában kapott reakcióelegyből 10 pl-t használunk fel. 420 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. e) Az Fi-Fz-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése A lOe) példában leirt módon 18 transzformáit kolóniában (13d példa) megvizsgáljuk az Fi-Fz-DNS-tartalmat. Radioaktiv mintaként az 5. és 6. példákban leirt oligodezoxinukleotidok keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammban 12 pozitív kolóniát kapunk, ezek közül öt a pML310, pML311, pML312, pML313, pML314 jelölést kapja. 14. példa A pML310 klón jellemzése A rekombinált pML310 plazmid ban az Fx-Fz-DNS-szekvencia jellemzése a 12. példában leirt módon az Fi-Fz-DNS Maxam és Gilbert (11) szerint végzett szekvenálásával történik. 10 Mg plazmid-DNS-t vizsgálunk. Az Fx-Fz-DNS nukleotidszekvenciája a szintetikus deszulfatohirudin-génre leírttal azonos. 15. példa A pML315 expressziós plazmid előállítása a) Az Fi-DNS összekapcsolása az Fz-DNS-sel és a pML315 expressziós plazmid megszerkesztése 24 Mg (= 1,3 pmól végek), illetve 26 Mg ( = 1,3 pmól végek) kémiailag szintetizált Fi-, illetve Fz-DNS-t (lásd 8. példa és I vázlat) 20 m1 térfogatban 50 mM Tris.HCl (pH = 8), 5 mM MgClz, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 Mg/ml összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on 5 egység EcoRII restrikciós endonukleázzal (Biolabs) megemésztünk. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot utána a 10c) példában leirt módon oldjuk és T«-DNS-ligázzal 3 órán át 15 °C-on kezeljük. Utána az elegyet fenol/kloroformmal extraháljuk és a 10b) példában leírt módon kicsapjuk. A DNS-csapadékot ezután oldjuk (vö. 10c példa) és EcoRI- és BamHI-restrikciós endonukleázzal 30 percen át 37 °C-on megemésztjük. Utána az oldathoz 70 ng (= 0,1 pmól végek) linearizált pHRil48/EcoRI/BamHI vektort (13aD példa) adunk, az egész oldatot TNE-re állítjuk és fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat alkohollal extraháljuk. A kapott DNS csapadékot, amely mindkét DNS-fragmentet (F1-F2-DNS/EC0RI/BamHI és pHRil48/EcoRI/BamHI/ tartalmazza, 20 m1 50 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM MgCk, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 Mg/ml zselatin összetételű oldatban oldjuk és 15 egység/pl Tí-DNS ligázzal (Biolabs) kezeljük 3 órán át 15 °C-on. Ily módon az oldatban a rekombináns pML315 plazmid képződik, amely az Fx-Fz-DNS-t (= deszulfatohirudin-gén) tartalmazza. b) Az E.coli HB101 transzformációja a pML-313 plazmiddal 10 m1 pML315 plazmidot tartalmazó elegyet (15a példa) alkalmazunk a kalciummal kazelt E.coli HB101 sejtek transzformációjára. Kb. 236 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk. c) Az Fi-Fi-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése A transzformált kolóniákat (15b példa) a 13e) példában megadott módon vizsgáljuk Fx-Fz-DNS előfordulására. Öt pozitív kolóniát kapunk, amelyeket pML315-pML319-el jelölünk. 16. példa A pML320 expressziós plazmid előállítása a) A szintetikus Fi-Fz-DNS összekapcsolása a pHRil 48/EcoRI/BamHI vektor-DNS-sel 20 Mg teljesen szintetikusan előállított deszulfatohirudin-gént F1-F2-DNS, (vö. 9. példa) 50 Ml 100 mM Tris.HCl (pH - 7,5), 50 mM NaCl és 100 Mg/ml zselatin összetételű oldat 20 Ml-ében EcoRI, majd BamHI restrikciós enzimekkel megemésztünk. Az oldatot TNE-re állítjuk, majd 30 Mg (= 50 nmól végek) pHRil48/EcoRI/BamHI vektor-DNS-t (vő. 13aD példa) adunk hozzá. Az oldatot fenol/kloroformmal extraháljuk és a DNS-t alkohollal kicsapjuk. A DNS-csapadékot a 10c) példában megadott módon Ti-DNS-ligázzal (Biolabs) kezeljük. Ily módon az oldatban rekombináns plazmid (pML320) képződik, amely az Fi-Fz-DNS-t (hirudin-gén) tartalmazza. b) Az E.coli HB101 transzformációja a pML- 320 plazmiddal A kalciummal kezelt E.coli HB101 sejtek transzformációja a lOd) példában leírt módon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 27
